1、ICS 65. 120 B 46 中华人民共和国国家标准GB/T 23874-2009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法Determination of xylanase activity in feed additives一Spectrophotometric method 2009-05-26发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2009-10-01实施发布G/T 23874-2009 目。吕本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由中国农业大学农业部饲料工业中心、武汉新华扬生物有限公司、广东溢多利生物技术股份有限
2、公司负责起草。本标准主要起草人:陆文清、曹云鹤、刘兴海、詹志春、刘亚力、陈清华。I 范围饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力。本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出量为10.0U/g。2 规范性引用文件GB/T 23874-2009 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3
3、 原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖最成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。在37oc、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放lmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。4 试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。4. 1 氢氧化锅溶液，浓度为200g/L 称取氢氧化纳20.0go加水溶解，定容至1
4、00mL。4.2 乙酸溶液，浓度为0.1mol/L 吸取冰乙酸0.60mL。加水溶解，定容至100mLo 4.3 乙酸铀溶液，浓度为0.1mol/L 称取三水乙酸纳1.36 g。加水溶解，定容至100mL。4.4 乙酸-z酸铀缓冲溶液，浓度为O.1 mol/L，pH为5.50称取三水乙酸纳23.14 g，加人冰乙酸1.70 mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH。如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液(4.2)或乙酸纳溶液(4.3)调节至5.50。4.5 木糖溶液(C5H1005)，浓度为10.0mg/mL 称取无水木糖1.000 g，加乙酸-乙酸纳缓冲溶液(4.4)溶解，定容至10
5、0mLo 4.6 木聚糖溶液，浓度为100mg/mL 称取木聚糖(SigmaX06271)1. 00 g，加人0.32g氮氧化锅，再加入90mL水，磁力搅拌，同时缓慢。SigmaX0627是商品名，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品能有相同的效果，则可使用这些等效的产品。1 G/T 23874-2009 加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min，加入0.5mL冰乙酸。继续磁力搅拌，测定其pH。如果pH为5.50，用乙酸一乙酸锅缓冲溶液(4.4)定容至100mL。如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液(4.2)或乙酸锅溶液(4.3)调节至5.
6、50，然后再用乙酸-乙酸锅缓冲溶液(4.4)定容至100mLo使用前适当摇匀。4oc避光保存，有效期为12h。4.7 DNS试剂称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌3s .-_, 5 s，水浴至45oc。然后逐步加入100mL 氢氧化纳溶液(4.1)，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意:在加人氢氧化纳过程中，溶液温度不要超过48OC)。再逐步加入四水酒石酸饵纳91.0 g、苯盼2.50g和元水亚硫酸纳2.50g。继续45oc水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加人的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1 000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储
7、存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后方可使用，有效期为180d。5 仪器与设备5. 1 实验室用样品粉碎机或碾钵。5.2 分样筛:孔径为0.25mm。5.3 分析天平:感量0.001go 5.4 pH计:精确至0.0105.5 磁力搅拌器:附加热功能。5.6 电磁振荡器。5. 7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45mo5.8 离心机:最大离心加速度不小于2000 g。5.9 恒温水浴锅z温度控制范围在30oC .-_, 60 oC之间，精度为0.1oC。5.10 秒表:每小时误差不超过5So 5. 11 可见分光光度计。5. 12 移液器:精度为1L。6 绘制标准曲线6. 1 吸取乙酸一乙酸纳
8、缓冲溶液(4.4)4.0mL，加人DNS试剂(4.7)5.0 mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL，制成标准空白样。6.2 分别吸取木糖溶液(4.5)1.00 mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL, 分别用缓冲溶液(4.4)定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40 mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。6.3 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL(做两个平行)，分别加人到刻度试管中，再分别加入2.
9、0mL缓冲液(4.4)和5.0mLDNS试剂(4.7)。电磁振荡3s .-_, 5 s，沸水浴加热5mino然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A值。以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。7 反应用酶液的制备7. 1 固体样品的反应用酶液制备按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.001g。加人40mL乙酸-乙酸纳缓冲溶液2 GB/T 23874-2009 (4.4)。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液(4.4)定容至100mL，在4oc条件下避光保存1h r-.- 2 ho
10、上离心机(5.8)1 OOOg离心3minr-.- 5 min，取上清液，再用缓冲溶液(4.4)做适当稀释(稀释后的待测酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mLr-.- O. 10 U/mL之间)。7.2 液体样品的反应用酶液制备液体样品可以直接用乙酸-乙酸锅缓冲溶液(4.4)进行稀释、定容稀释后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL-O. 10 U/mL之间)。如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用乙酸溶液(4.2)或乙酸纳溶液(4.3)调节校正至5.50，然后再用缓冲溶液(4.4)做适当稀释定容。8 测定步骤吸取10.0mL木聚糖溶液(4.6), 37 oc平衡20min
11、o 吸取10.0mL经过适当稀释的酶液(7.1或7.2), 37 oc平衡10min。吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37oc平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂(4.7)，电磁振荡3s-5 s。然后加入2.0mL木聚糖溶液(4.的，37oc保温30min，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s-5 s。以标准空白样(6.1)为空白对照，在540nm处测定吸光度ABo吸取2.00mL经过适当稀释的酶液已经过37oc平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0mL木聚糖(4.6) (已经过370C平衡)，电磁振荡3sr-.- 5 s ,37
12、oC精确保温30mino加入5.0mLDNS试剂(4.7), 电磁振荡3sr-.- 5 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s,_ 5 s。以标准空白样(6.1)为空白对照，在540nm处测定吸光度AEo9 试样酶活力的计算用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力按式(1)和式(2)计算:Xn = (AE -AB) X K十CoJ,/ n _ L ,.r. . :n_: . I V_j X 1 000 ( 1 ) u M X t( 式中zXn一一稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/mL;AE一一一酶反应液的吸光度;AB一一一酶空白样的吸光度;K一一
13、一标准曲线的斜率;Co一一一一标准曲线的截距;M一一木糖的摩尔质量，M(CsH 100S) = 150.2 g/mol; t一一酶解反应时间，min;1000-一转化因子，1mmol = 1 000molo Xn值应在0.04U/mLr-.- O. 10 U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。X = Xn X Df 式中zX一一试样中木聚糖酶的活力，U/g(或U/mL); Df一一试样的稀释倍数。. ( 2 ) 3 GB/T 23874-2009 酶活力的计算值保留三位有效数字。10 重复性每个试样应取两份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平
14、均值为最终的酶活力测定值。4 G/T 23874-2009 附录A(资料性附录)样品酶活力与建议称样量的对应关系样品酶活力与建议称样量的对应关系见表A.l:表.l木聚糖酶活力/(U/g)(或者U/mL) 称样量/g(或者mL)二三2000 0.10. 2 5001 999 O. 20. 5 h 200499 O. 51. 0 50199 1. 02. 0 1049 2. 05. 0 同，民5 gON!走的NH闰。华人民共和国家标准饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法GB/T 23874-2009 国中骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销普印张o.75 字数9千字2009年8月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2009年8月第一版苦定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-38462 GB/T 23874-2009 打印日期:2009年10月14日
