1、ICS 65.020.30 B 41 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 28630. 1-2012 自斑综合征(WSD)诊断规程第1部分:核酸探针斑点杂交检测法Diagnostic protocols for white spot disease一Part 1 : Dot blot hybridization method with DNA probe 2012-07-31发布2012-11-01实施. ()()!2!$.f AjUVV41$。0.5mL/cm2，每次换袋hc) 1 X缓冲液A，2min/次X1次，室温(在洗涤皿中进行，间歇摇晃); d) 将两张杂交膜分别置于两个杂交袋中，加
2、入溶有封闭剂的1X缓冲液A，封口，室温放置30 min; e) 剪开两个杂交袋一角，分别加入1/50体积的100X碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG)，在振荡器上于室温振荡30min。6.9 显色完全剪开两个杂交袋，取出膜，按下列步骤洗涤:a) 1X缓冲液A，15min/7XX2次，室温(在平皿中进行，间歇摇晃); b) 1X缓冲液B，2min/次Xl次，室温(在平皿中进行，间歇摇晃)。将两张杂交膜分别装于两个杂交袋中，加入溶有显色剂A和显色剂B的1X缓冲液B(0.2mL/cm2) , 封口，置于暗盒中显色15min 120 min(显色时间与温度有关)。中间可取出短时间观察，勿搅动，
3、观察后立即放回。6. 10 观察测试膜上阳性对照样品明显出现颜色而杂交膜本底刚有所变色时，立即剪开杂交袋，取出膜，置于蒸锢水中漂洗15min30 min终止显色。将膜置于滤纸上晾干。对光观察，记录结果。7 结果判定7. 1 测试膜上阳性对照样品的显色应为淡蓝褐色，阴性对照样品元色，对照膜上两个样品均元色。膜上的黄色、红色等颜色都不属于病毒导致的显色。检测结果的判定要将测试膜与对照膜对照进行。测试膜上样品斑点显蓝褐色而对照膜对应斑点不显色或颜色比测试膜上浅得多时，该样品判断为阳性。依据显色结果强弱分为弱阳性结果(+)、阳性结果(+，+)和强阳性结果(十+)。7.2 测试膜斑点不显色，该样品判断为
4、阴性。7.3 测试膜与对照膜均有明显的颜色，表明样品存在明显的非特异性反应干扰，测试结果元效，应重新取样检测。白斑综合征(WSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图参见附录C.7.4 阳性结果表明存在WSSVDNA。活虾和敏感宿主阳性表明己受到WSSV感染;对虾产品和其他产品阳性表明携带WSSV。7.5 结果可疑时，补充组织病理学诊断或PCR检测进行结果确认。4 A.1 A.2 A.3 A.4 A.5 泡膜灌(20x SSC) 氯化铀(NaCD拧橡酸三铀(2Hz0) 加水溶解定容至调节pH至7.0高压蒸汽灭菌后，室温贮存。研磨灌20XSSC O. 5 mol/L EDT A 10% SDS 琉基乙
5、醇Tris平衡酣至饱和(即溶液呈乳白色)约加水定容至附录A(规范性附录)试剂配方175.32 g 88.23 g 1000 mL 125 mL 70 mL 50 mL 2.5 mL 15 mL20 mL 500 mL 溶解过程有絮状沉淀可以稍加热并搅拌温匀。4.C贮存，使用时取上清。5XSSC 20XSSC 250 mL 水750 mL 混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4.C贮存。预杂交母班5XSSC 10 mL 20 % Sarkosyl 50L 10% SDS 20L 混匀，4OC贮存。10 x缓冲液ATris 121. 1 g 氧化铀(NaCD87.7 g 加水溶解至800 mL 用浓盐酸
6、调节pH至7.5GB/T 28630.1-2012 5 GB/T 28630.1-2012 加双蒸水定容至1 000 mL 高压蒸汽灭菌，40C贮存。A.6 1 x缓冲液A10X缓冲液A水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存。100 mL 900 mL A.7 10 x缓冲液BTris 氧化铀(NaCD加水溶解至用浓盐酸调节pH至9.5六水合氯化镜(MgC12.6H20) 加双蒸水定容至121. 1 g 58.4 g 800 mL 101. 6 g 1000 mL 混匀，0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存，出现沉淀后丢弃。A.8 1 x缓冲液B10X缓冲液B水100 mL 900 mL ?
7、昆匀，0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存，出现沉淀后丢弃。A.9 1 x清洗液I20XSSC 10 mL 10% SDS 0.1 mL 加水定容至100 mL 混匀，室温贮存，若出现白色浑浊沉淀加热直至溶解后使用。A. 10 1 x清洗液E20XSSC 0.5 mL 10% SDS 0.1 mL 加水定容至100 mL 混匀，室温贮存，若出现白色浑浊沉淀加热直至溶解后使用。A.11 显色jfljA6 四氮嗖蓝(NBT)二甲基甲酷胶100 mg 0.931 mL 水避光，一20.C贮存。A.12 显色剂B5-澳-4-氯-3-P51噪磷酸-甲苯胶盐(BCIP)二甲基甲自克服避光，一20.C贮存。A
8、.13 溶有显色荆A和显色弗tlB的1X缓冲撞B1X缓冲液B显色剂A显色剂B立即使用。0.402 mL 100 mg 2 mL 1 mL 4. 5L 3. 5L GB/T 28630.1-2012 7 G/T 28630.1-2012 附录B(资料性附录)自斑综合征病毒(WSSV)核酸探针斑点杂交检测标记探针序到1 AGTITCCAGA AGACAACKrA iITTAGCTGT AiITTGGACGA GGAGACTCT TGTAATGAGA F 61 GAACCACAAAATTCTTCTTC CCGTCTTITCGGTATAAAA GTAGTCCCKr AKl虹口TTCC121 TITCT
9、GGACT ACCACATC盯CTTCGfAAGGGAACKrKr CTGACCGACT TTCTCKr巳AA181 GGGCTGKrCT CCKrTTCTTG TTGTGCTDG AGCCGKrTTG TA:盯CCCCGTCGTTCACG寸241 KrAGTGCKr KrAGAACAGT GGGKrGAAAG GAACTTGTCG GT立CGTGTTCAGTTGAC 301 AAGKrAACTG GACGCKrTTG CTAGTTCTGG AGGGACGTCC TGGTTTITGT T1TTGTTGA 361 AGTAGGTITT KrCTTTTTCC T.ATITAAGCA CACACCC
10、TTT GAATAA:fGT GTKrGCGiITT 421 CGCATTGKrGITKrGCAGA TTGTGAGTGC TGGAGAAAAT GGTKrCTCAA AAT:;GTAGC 481 TGGTTCAATA A:TI寸CTGGTTCAACTTCCTG TTGTTC口CTTCCTCKrCTT TCTCTTCCTT 541 ATTTITGACA CCDGAACTC TAAGGTTGGCAGTACI立iITTiITTCTGGCTG CAGCCGTGCT R 601 GGAGCAGAA GGGGAAGA 8 GB/T 28630.1-2012 附录(资料性附录)白斑综合征(WSD)核酸探针
11、斑点杂交检测结果示意图C 5 4 3 2 i蜷ijA s. 警C D D4一一阳性对照;D5 阴性对照;Bl一一强阳性结果.+十;C4-一阳性结果.+;C5-一阳性结果.+;Cl一弱阳性结果.+;其他为阴性结果，。白斑综合征(WSD)核酸探针斑点杂交检测结果示意图图C.19 N-ON-.O伺NH阁。华人民共和国家标准自斑综合征(WSD)诊断规程第1部分:核酸探针斑点杂交检测法GB/T 28630. 1-2012 国中春中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号。00045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷开本880X 1230 1/16 印张1字数19千字2012年11月第一版2012年11月第一次印刷祷书号:155066. 1-45620 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价打印日期:2012年11月28日F002
