1、ICS 65.020.30 B 41 道画中华人民共和国国家标准GB/T 28630.2-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分:套式PCR检测法2012-07-31发布Diagnostic protocols for white spot disease一Part 2 N ested PCR method 中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2012-11-01实施发布GB/T 28630.2-2012 前言GB/T 28630(白斑综合征(WSD)诊断规程分为五个部分:一一第1部分z核酸探针斑点杂交检测法;一一第2部分z套式PCR检测法;第3部分:原位杂交
2、检测法;第4部分z组织病理学诊断法;一一第5部分:新鲜组织的T-E染色法。本部分为GB/T28630的第2部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本部分起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部全国水产技术推广总站。本部分主要起草人:黄佳、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦、刘莉。I GB/T 28630.2-2012 自斑综合征(WSD)诊断规程第2部分:套式PCR检测法警告:使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责
3、任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围GB/T 28630的本部分规定了白斑综合征病原的套式PCR检测方法所需试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于在对虾的各种样品、环境生物和饵料生物的各种样品，以及其他各种非生物样品中对自斑综合征病原带毒情况的高灵敏度定性检测，以进行病原筛查和疾病的确诊。本部分单独使用时不适用于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件。GB/T 2863
4、0.4-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法3 原理3. 1 自斑综合征的病展和病理学特征见GB/T28630.4-2012的2.103.2 技术原理聚合酶链式反应(po!ymerasechain reaction，PCR)是以待测样品的一段DNA作为模板，以与模板两端序列互补的一对特异性寡核昔酸序列作为引物，在四种脱氧核糖核昔三磷酸存在下，利用依赖DNA的DNA聚合酶的合成作用。经过数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两个引物-之间的DNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等于段检测到被特异性扩增的片段，从而可揭示微量病毒DNA的存在。套式PCR是在第
5、一步PCR扩增的产物内，再用一对引物进行第二步PCR扩增。套式PCR可大大增加PCR检测的灵敏度和反应特异性。4 试剂和材料4. 1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂和蒸懦水或去离子水或相当纯度的水。4.2 元水乙醇。4.3 液体石蜡。4.4 含氧消毒剂z医用品或水产药物。4.5 琼脂糖z电泳级。1 GB/T 28630.2-2012 4. 6 1 kb DNA Marker:生化试剂。4.7 Tris平衡酣(饱和酣):生化试剂。4.8 Taq DNA聚合酶(5U/fLL):生化试剂，一20.C保存。4.9 10XPCR缓冲液z生化试剂，元Mg2+，随TaqDNA聚合酶提供，
6、-20.C保存。4. 10 氯化镜榕液(25mmol/L):生化试剂，一20.C保存。4.11 dNTP:生化试剂，含dATP，dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L的混合物，一20.C保存。4. 12 10 fLmol/L引物F1:5-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3，外侧正向引物，用来扩增WSSV DNA的1447 bp产物，一20.C保存。4. 13 10mol/L引物R1:5-T AA TGCGGGTGT AATGTTCTTACGA-3 ，外侧反向引物，用来扩增WSSV DNA的1447 bp产物，-20.C保存。4.14 10mol/L引物F2:5-GTAA
7、CTGCCCCTTCCATCTCCA-3，内侧正向引物，用来从第一步PCR扩增的1447 bp产物中再扩增出941bp的产物，一20.C保存。4. 15 10 fLmol/L引物R2:5-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3，内侧反向引物，用来从第一步PCR扩增的1447 bp产物中再扩增出941bp的产物，一20.C保存。4.16 10mol/L引物F3:5-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3，正向内参照引物，扩增十足类动物DNA中848bp的片段，-20.C保存。4.17 10mol/L引物R3:5-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3，反向内
8、参照引物，扩增十足类动物DNA中848bp的片段，-20.C保存。4.18 20 mg/mL蛋白酶K:见附录A的规定。4.19 TE缓冲破:见附录A的规定。4.20 抽提缓冲液z见附录A的规定。4.21 10 mol/L乙酸镜:见附录A的规定。4.22 酣-三氯甲烧-异戊醇(25: 24 : 1):见附录A的规定。4.23 1X电泳缓冲液z见附录A的规定。4.24 6X载样缓冲液:见附录A的规定。4.25 10 mg/mL澳化乙链(EB)贮存破:见附录A的规定。4.26 70%乙薛z见附录A的规定。4.27 阳性对照为己知受WSSV感染且PCR结果显示明显阳性结果的WSSVDNA模板，一20.
9、C 保存。4.28 阴性对照为已知未受WSSV感染且PCR结果显示阴性结果的对虾组织DNA模板，一20.C 保存。4.29 空白对照以元菌双蒸水为模板。5 器材和设备5.1 PCR仪。5.2 电泳仪z输出直流电压oV600 Vo 5.3 水平电泳槽:50mL500 mL，带有5cm20 cm宽度的凝胶船及相应的样孔梳。5.4 紫外观察仪z可遮挡可见光干扰，在230nm300 nm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相机架。5.5 台式高速离心机:用于PCR前区对1.5 mL塑料微量离心管离心，转速可达12000 r/min以上。5.6 手掌型离心机t用于PCR后区对0.2mL PCR管的离心，塑料转
10、头，转速2000 r/min 4000 r/min o 5. 7 水浴锅。G/T 28630.2-2012 5.8 普通冰箱:具冷藏箱，并带18 .C以下冷冻箱体。5.9 微量移液器z量程o.5L10L、5L40L、40L200L、200Ll000L各4支，应按洁净区、样品区、扩增区和电泳区分为4套隔离使用。5. 10 电炉或微波炉等其他加热设备z可满足10mL50 mL液体在三角烧瓶中加热20mino 5. 11 三角烧瓶:容量100mL250 mLo 5. 12 灭菌0.2mL PCR管:经高压蒸汽灭菌，一次性使用。5. 13 微量移液器枪头:与各种规格的微量移液器配套使用，经高压蒸汽灭菌
11、，并一次性使用。5. 14 医用剪刀。5. 15 医用慑子。5. 16 玻璃研磨棒或塑料研磨棒z用于在1.5 mL塑料离心管中研磨样品。5.17 1. 5 mL塑料微量离心管z经高压蒸汽灭菌，一次性使用。5. 18 塑料或乳胶手套:一次性使用。5. 19 吸水纸。6 操作步黯6. 1 准备PCR的反应体系6.1.1 PCR反应体系的准备应在洁净区完成。6.1.2 第一步PCR的反应体系中使用引物F1和R1，模板为抽提的样品DNA，其反应预混物见表10表1100份第一步PCR的反应预混物所需试剂组成试剂25L体系50L体系100L体系试剂终浓度10XPCR缓冲液(无Mg2+)250L 500L
12、1000L 1XPCR缓冲液(元Mg2+)氯化侯溶液(25mmol/L) 150L 300L 600L 1. 5 mmol/L dNTP 50L 100L 200L 200mol/L 10mol/L弓|物F1250L 500L 1000L 1mol/L 10mol/L引物R1250L 500L 1000L 1mol/L 灭菌双蒸水1440L 2880L 5 760L Taq DNA聚合酶(5U/L) 10L 20L 40L 0.02 U/L 100份反应预混物总体积2400L 4800L 9600L 注:25L体系模板量1L/反应管;50L体系模板量2L/反应管;100L体系模板量4L/反应管
13、。6. 1.3 第二步PCR的反应体系中使用引物F2和R2，其反应预混物见表20表2100份第二步PCR的反应预混物所需试剂组成试剂25L体系50L体系100L体系试剂终浓度10XPCR缓冲液(元Mg2+)250L 500L 1000L 1XPCR缓冲液(元Mg2+)氯化侯溶液(25mmol/L) 150L 300L 600L 1. 5 mmol/L dNTP 50L 100L 200L 200mol/L 10mol/L引物F2250L 500L 1 000L 1mol/L 3 GB/T 28630.2-2012 表2(续)试jfIJ 25L体系50L体系100L体系试剂终浓度10mol/L引
14、物R2250L 500L 1 000L 1mol/L 灭菌双蒸水1 290L 2580L 5 160L TaqDNA聚合酶(5U/L) 10L 20L 40L 0.02 U/L 100份反应预混物总体积2250L 4 500L 9000L 注:25L体系模板量2.5L/反应管;50L体系模板量5L/反应管;100L体系模板量10L/反应管。L一一6. 1. 4 按照所需的反应体系，根据近期工作量的需要，在洁净区分别配制好100份1000份第一步PCR和第二步PCR的元TaqDNA聚合酶的反应预混物，按10份/支100份/支对两步的元酶反应预混物分别分装，冻存于一20.C。6.1.5 检测前，在
15、洁净区取出所需份数的第一步PCR和第二步PCR的无酶预提物解冻，按比例分别加人所需的Taq酶量，混匀即为完全的第一步PCR和第二步PCR反应预混合物，再按1份/支将预混合物分别分装到0.2mLPCR管中，由匀。若PCR仪没有热盖功能，则再于各管中加人50L液体石蜡。将分装好的两步PCR的反应预混物同时带入样品区待用。6.2 样晶准备6.2.1 样品的处理应在样品区完成。6.2.2 样品采集的要求见GB/T28630.4一2012中附录B的规定。6.2.3 活体或冰冻幼体、仔虾及幼虾个体样品约5mg100 mg (去掉幼虾眼)。活体或冰冻的成虾鲍、胃、游泳足或步足样品约5mg100 mgo活体或
16、冰冻饵料生物样品约5mg100 mgo池底表土样品约500mg。6.2.4 将上述待检样品放人灭菌1.5 mL微型离心管中，应避免各样品间的交叉污染。所有非次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配制的有效氯含量为3.0X10-3的含氯消毒剂中5min，经无PCR产物污染的自来水充分清洗，再经蒸馆水淋洗后方可用于下一个样品。6.3 DNA的提取6.3.1 样品DNA的提取应在样品区完成。6.3.2 在样品剪碎后加人抽提缓冲液500L，用研磨棒充分研磨，37.C温洛1ho 6.3.3 加人2.5L20 mg/mL蛋白酶K，至终故度100g/mL，混匀后置于50.C水浴3h，不时旋动。6.3.4
17、 将溶液冷却至室温，加人等体积平衡酣，颠倒海合10min，于10000 r/min离心3min分离两相。6.3.5 水相移至新塑料微量离心管中，加人等体积酣-三氯甲烧-异戊醇，颠倒混合10min，于10000r/ mln离心1min分离两相。6.3.6 水相移至一新灭菌微型离心管中，加入等体积三氯甲烧-异戊醇(24: 1)，颠倒混合10min，于10 000 r/min离心1min分离两相。6.3.7 水相移至一新灭菌微型离心管中，加人100L10 mo1/L乙酸镜，混匀后，再加人两倍体积预冷元水乙醇(一20.C)混匀，-20.C放置2h. 10 000 r/min离心10min，弃上清。6.
18、3.8 用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000 r/min离心5min，小心倾去上清，最后沉淀于室温晾干。6.3.9 沉淀晾干后加入100L灭菌双蒸水溶解DNA。GB/T 28630.2-2012 6.3. 10 若DNA样品应保存，建议溶解于100LTE缓冲液中并保存于一20.C。6.4 DNA提取质量及体质监控6.4. 1 参照表1的PCR反应预混物体系，引物使用10mol/L引物F3和10mol/L引物R3按6.5.1.5程序进行样品提取质量及反应体系监控。6.5 套式PCR操作6.5. 1 第一步PCR6.5. 1. 1 以下一个步骤的操作应在样品区完成。6.5.1.2 对每份样品用
19、单独的枪头定量吸取待测模板，待测模板除抽提的样品DNA外，同时设阳性对照、阴性对照和以无菌双蒸水为模板的对照。分别将各模板溶液加到各支己加有第一步PCR反应预混物的0.2mL PCR管的管盖上，盖严管盖。6.5.1.3 以下两个步骤的操作只能在扩增区完成。6.5.1.4 将PCR管带人扩增区，放入90.C预热的PCR仪中，预热反应预混合物2min.逐一快速取出PCR管在手掌型离心机上离心1s2 s，立即放回预热的PCR仪上。盖上PCR仪的盖子。6.5. 1. 5 按以下程序进行扩增:94 .C 4 min、55.C 1 min、72.C 2 min，l个循环;94 .C 1 min、55.C
20、1 min、72.C 2 min，39个循环;72.C延伸5min. 4 .C保温。6.5.2 第二步PCR6.5.2.1 在进行6.5.1.4步的同时，将已准备好的第二步PCR反应预混物的反应管带人扩增区。6.5.2.2 在扩增区，根据所选取的反应体系的总体积，分别从第一步的各PCR管中取相应体积的模板，加到第二步PCR预混物各管的管盖上。应小心操作，防止各样品间交叉污染。6.5.2.3 将第二步的各PCR管放入90.C预热的PCR仪中，预热反应预混合物2min。逐一快速取出PCR管在手掌型离心机上离心1s2 s，立即放回预热的PCR仪上。盖上PCR仪的盖子。按照与第一步PCR相同的扩增循环
21、的程序进行扩增。扩增完毕的PCR管只能在电泳区打开。6.6 PCR产物的分析6.6. 1 琼脂糖凝肢的制作6. 6. 1. 1 在电泳区用1X电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝肢，建议于三角烧瓶中配制，在电炉上或微波炉中加热至溶液完全透明(为避免煮沸时液体外溢，胶液体积应少于容器体积的1/的。待溶液冷却至60.C左右，加入10mg/mL澳化乙链CEB，有毒)至终浓度O.5g/mL，摇匀。6.6. 1. 2 将凝胶液缓缓倒入设置好样孔梳和防漏条/套的水平放置的凝胶船，胶液厚度O.6 cm 0.8 cm.样孔梳底部水平深入凝肢层约O.3 cmO. 5 cm，并距凝肢底部0.2cm，以免穿透。6.6.
22、 1.3 待凝胶完全凝固后，小心拔掉样孔梳，去掉防漏条/套，即可用于电泳。6.6.2 电泳6.6.2.1 将制备好的琼脂糖凝胶连同凝胶船一起装人水平电泳槽，加样孔朝负极，加入1X电泳缓冲液至没过胶面约1mm2 mm的深度。6.6.2.2 将10L第二步和第二步PCR反应产物分别与2L6X载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时至少设一个泳道加人5L1 kb DNA Marker的载样混合物。6.6.2.3 盖上电泳槽并通电，使DNA由阴极向阳极移动。在1V/cm5 V/cm的电压下电泳约1h , 当载样缓冲液中的澳酣蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝肢的l/22/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪上观
23、察或照相。5 GB/T 28630.2-2012 6.6.3 相对分子质量计算6.6.3. 1 测定Marker的每条区带到加样孔的迁移距离(即泳动率)，将各区带相对分子质量的对数值对其泳动率作图，各点的排列应该接近是一条下降的直线，画出其趋势线，求出相对分子质量计算的回归方程。6.6.3.2测量各样品泳道出现的条带的泳动率，利用Marker所得出的相对分子质量计算的回归方程，计算各条带的泳动率。6.6.3.3 由于凝胶在电泳时，其中的温度和电场的不均一性，以及电泳时所加样品的离子强度或DNA浓度的差异，相同相对分子质量的DNA片段在凝胶中的泳动率会有所差异，各条带相对分子质量的实际测量的结果
24、允许有1%3%的误差。6.6.4 后处理观察完毕的凝肢和污染有PCR产物或EB的一次性用品和榕液应立即按附录B的规定处理。7 结果判定7. 1 十足类生物样品:DNA提取质量及反应体系监控中，样品在848bp处会有一条特定条带。7.2 被检生物样品:第一步PCR，阳性对照在1447 bp处有条带，阴性对照和无菌水为模板设立的空白对照无任何条带;第二步PCR，阳性对照在941bp处有条带，阴性对照和空白对照无任何条带。检测样品第一步PCR后在1447 bp处有条带或第二步PCR后在941bp处有条带均可判为阳性。检测样品第一步PCR后在1447 bp处元条带且第二步PCR后在941bp处元条带可
25、判为阴性。7.3 白斑综合征(WSD)套式PCR检测产物序列参见附录C。7.4 条带的亮暗表示PCR产物数量的多少，但并不对应于模板的量的多少。样品的电泳结果参照阳性对照和阴性对照组进行判读。7.5 阳性结果表明样品中存在WSSVDNA。对活虾和敏感宿主阳性表明己受到WSSV感染;对虾产品和其他产品阳性表明曾受到WSSV感染或受到WSSV污染。7.6 电泳结果分析和问题排除方法见表3。表3电泳结果分析试验结果结果判读及原因分析问题排除十足类动物样品DNA提取质量及体系监控反应中样品在848 bp处有条带。被检生物样品第一步PCR，阳性对照在1447 bp处有条带，阴性对照和元菌水为模板设立的空
26、白对照元任何条带FPCR反应正常，结果有效第二步PCR，阳性对照在941bp处有条带，阴性对照和空白对照元任何条带。阳性样品第一步PCR后在1447 bp处有条带或第二步PCR后在941bp处有条带。阴性样品第一步PCR后在1477 bp处无条带且第二步PCR后在941bp处无条带6 GB/T 28630.2-2012 表3(续)试验结果结果判读及原因分析问题排除阳性对照有条带，但Marker没有影像Marker失效或量太少更换Marker或增加其加样量Marker有影像，但十足类动物样品在PCR反应失败检查并更换PCR反应所用试剂848 bp处元条带以及PCR程序是否正确微量移液器污染清洗微
27、量移液器，只能用PCR后区的微量移液器跑电泳试剂污染更换试剂阴性对照组在1447 bp或941bp处有条环境污染清洁实验室及仪器设备，参见附带出现录B禁止从PCR后区到PCR前区的操作污染交流，禁止从电泳区到PCR操作区的交流，加强操作隔离，参见附录BDNA提取失败检查提取DNA所用试剂情况，重新试验用OD260/OD280比值来确定。其DNA不纯致使PCR抑制物正常比值应在1.6-1.8之间，若低介入于1.6则表示杂质过多。应重新提阳性对照和阴性对照组正常，但十足类动取DNA物样品中无任何条带(包括无848bp条带模板太少，第一步的产物被过增加第一步PCR的模板浓度，不度稀释稀释第二步的模板
28、用电泳检查第一步PCR产物，若可见1447 bp条带，则记录该样品第一步PCR产物过浓为阳性;若无条带，稀释样品或第二步PCR模板后再次做第二步PCR做好热启动操作。样晶先要加未注意热启动操作，使PCR到PCR管盖上，反应预混物预热出现非特异性扩增后，短暂离心(数秒)以混入样品，迅速放回预热PCR仪中Marker正常，但阳性对照、阴性对照和样品出现较多杂带或明显的弥散区酶活性变化、dNTP浓度变化确认预混物制备的准确性、试剂或Mg2+浓度差异质量，对不同批次的酶重新测定最佳Mg2+离子浓度温度控制异常检查PCR仪是否存在复性温度过低的情况7 GB/T 28630.2-2012 表3(续)试验结
29、果结果判读及原因分析问题排除紫外观察仪故障检查紫外观察仪背景发红太亮减少EBa用量，将凝胶置于清水中30min后再观察结果凝胶上元影像，包括DNAMarker 凝胶片太厚重新制作琼脂糖凝胶片电极颠倒或电泳时间过长重新加样电泳EB分解失效重新配置漠化乙键(EB)a澳化乙键(EB)有毒，试剂的操作和废弃物的处理按附录B的规定。8 GB/T 28630.2-2012 A. 1 1 moI/L Tris HCI (pH8. 0) Tris 附录A(规范性附录)试jfIJ配方121. 1 g 水800mL 溶解后加入约42mL浓盐酸调pH接近8.0，冷却至室温，再用2.5mol!L盐酸调整pH至8.0。
30、加水定容至1000 mL 分装后，高压蒸汽灭菌，室温贮存。A. 2 O. 5 moI/L EDTA (pH8. 0) 乙二肢四乙酸二铀(EDTA-Na2 2H20) 18.6 g 水80mL 磁力搅拌，用2.5mol!L氢氧化铀调节溶液pH值至8.0，完全榕解，定容至100mLo 高压蒸气灭菌，室温贮存。A.3 TE缓冲液(pH8.0)1 mol!L Tris HCl (pH8.0) 0.5 mol!L EDT A (pH8.0) 加水定容至高压蒸气灭菌，4.C贮存。A.4 1 mg/mL膜RNA酶10 mL 2 mL 1 000 mL 膜RNA酶10mg TE缓冲液(pH8.0)10 mL
31、溶解后，于100.C加热15min，缓慢冷却至室温，分装100L/管，-20.C贮存。A.5 10% SDS SDS (十二烧基硫酸铀)水10 g 90 mL 加热至68.C助榕，加人几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2，加水定容至100mL。室温贮存。若溶液有结晶形成，用前加热融解即可。SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平上的SDS。9 GB/T 28630.2-2012 A.6 抽提缓冲液1 mol/L Tris HCl (pH8. 0) 0.5 mol/L EDTA (pH8. 0) 1 mg/mL膜RNA酶10% SDS 加水定容至1昆匀，室温贮
32、存。A.7 20 mg/mL蛋白酶K蛋白酶K水1 mL 20 mL 2 mL 5 mL 100 mL 20 mg 1 mL 溶解后分装于元菌离心管中(0.25mL/管)，-20 .C下保存。A.8 10 mol/L Z酸接乙酸镀水77 g 30 mL 加水定容至100mL，经0.45m滤膜过滤除菌。4.C贮存。A.9 酣-三氯甲虫完-异戊醇(25: 24 : 1) Tris平衡酣三氯甲烧异戊醇50 mL 48 mL 2 mL 0.01 mol 1 L Tris HCl(pH8. 0) 100 mL 1昆匀后，自然分层。置于棕色瓶内，4.C贮存，1个月内使用。A.10 50 x电泳缓冲液Tris
33、 冰乙酸0.5 mo1/L EDTA(pH8. 0) 加水定容至室温贮存。A.11 1 x电泳缓冲液50X电泳缓冲液加水定容至室温贮存。10 242 g 57.1 mL 100 mL 1000 mL 20 mL 1000 mL A.12 6 x载样缓冲液荒糖加水溶解，定容至澳酣蓝溶解后，4.C贮存。A. 13 0.5 moI/L高缸酸锦(KMn04)高锺酸饵(KMn04)加水搭解，定容至室温贮存。A.14 2.5 mol/L盐酸在500mL水中加入浓盐酸(37%HCl) 混匀并冷却后，加水定容至室温贮存。A. 15 2.5 moI/L氢氧化铀40 g 100 mL 0.25 g 79 g 1
34、000 mL 246.35 mL 1000 mL 氢氧化铀100 g 加水700mL潜解，冷却后定容至1 000 mL 置于聚丙烯塑料瓶中，旋紧瓶盖，室温贮存。A. 16 10 mg/mL滇化Z键(EB)贮存液澳化乙键(EB)水10 mg 1 mL GB/T 28630.2-2012 磁力搅拌数小时以确保其完全榕解。室温保存于棕色瓶或用铝铀包裹的瓶中。澳化乙键是强诱变剂井有中度毒性，称量时应戴面罩和于套，避免溅洒，试剂瓶应注明，使用时应戴手套，参见附录B。A.17 70%Z醇元水乙醇加水30mL，混匀，定容至分装后，室温贮存。70 mL 100 mL 11 GB/T 28630.2-2012
35、附录B(规范性附录)PCR实验室要求和化学药品及仪器设备操作安全注意事项B.1 PCR实验室分区PCR前和PCR及PCR后的工作范围应分区成为相互隔离的实验室，所需试剂、仪器、实验室各种用品、工作服等均应独立使用。长期从事常规性PCR检测工作的人员也应进行专门分工。专用于进行套式PCR检测的实验室应分为四个隔离的区域(房间)，包括洁净区、样品区、扩增区、电泳区。洁净区和样品区属于PCR前区，扩增区和电泳区属于PCR后区。其中洁净区专用于配制和分装PCR所用试剂，不应接触任何样品F样品区专用于进行样品的处理和第一步PCR的加样，不应接触任何PCR产物;扩增区专用于进行PCR循环和第二步PCR的加
36、样，不应暴露第二步PCR产物，由于暴露第一步PCR产物也可能造成严重污染，应对扩增区经常进行产物污染的消除处理E电泳区专用于PCR产物的检测。只允许从洁净区样品区扩增区电泳区的单向物流，同时PCR后区应尽可能避免各步PCR产物的污染。应定期对专门从事PCR的实验室各区的产物污染程度进行测试评估，并有针对性地进行消除产物污染的处理。B.2 含PCR反应产物的材料PCR反应产物的不当处理会造成实验室的严重污染，含PCR反应产物的用品，如枪头、离心管、凝胶和手套等应用3.0XlO-3浓度的含氯消毒剂溶液处理后，再以塑料袋密封包装后丢弃，含有PCR反应产物的溶液应加入含氧消毒剂达3.0X 10-3的浓
37、度，经处理10min以上后方可直接倒入下水道口。可能沽污PCR反应产物的衣物、桌椅、拖把、扫帚、垃圾桶等严禁带入PCR前区。应保存的PCR产物只能密封保存在PCR后区。B.3 7:臭化Z键澳化乙键为致癌物，有中度毒性，可通过皮肤或粘膜吸收，对环境有污染，应按照以下方法来进行操作或处理。B. 3.1 漠化Z提浓溶班的净化处理加人足量的水使澳化乙键的浓度降低至0.5mg/mL以下。加入1倍体积的0.5mol/L高锺酸饵，小心混匀后再加1倍体积的2.5mol/L盐酸。小心混匀，于室温放置数小时。加入1倍体积的2.5 mol/L氢氧化销，小心混匀后可丢弃该溶液。0.5 mo1/L高锚酸饵、2.5mol
38、/L盐酸、2.5mol/L氢氧化铀按附录A的规定配制。B.3.2 滇化zt定稀溶液的净化处理每100mL溶液中加入100mg粉状活性炭。于室温放置1h，不时摇动。用Whatmanl号滤纸过滤榕液，丢弃滤液。用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。GB/T 28630.2-2012 B.3.3 漠化Z徒固体的操作应避免吸人或食人漠化乙链的固体或粉尘。操作人员要穿戴实验服及手套，如果不慎沾到皮肤，立即用大量清水冲洗。B.4 酣、三氯甲皖等有毒害有机溶剂有强腐蚀性，操作时要穿戴实验服及手套。应避免吸入或食人。直接的皮肤接触应立即用大量清水冲洗。B.5 电泳电泳时会产生100V600 V的直流电压
39、，同时电极处会产生大量的微小气泡。应盖好电泳槽上盖以避免气泡炸裂导致PCR产物的污染和有毒试剂的挥发。避免接触电极及液面以防触电。B.6 紫外线长时间暴露于紫外线下会对眼睛及皮肤造成严重伤害，因此在使用紫外观察仪时应穿上实验服、护目镜及防护面罩。13 GB/T 28630.2-2012 附录C(资料性附录)白斑综合征(WSD)套式PCR检测产物序列1 GTCGACAGAC TACTAACTTC AGCCTATCT.A GTAAAACAAG CTAAAAGATT CGACGGAGTT Fl 61 GACCCAGCCT TCCCTGCCGC CCTCACCTGC GCTTCTCACC TCATGC
40、TTTC TTCCATGGAT 121 TCCCATACAA AGTCATCTTT CATGGACAAC ATCAAATTGC ACATGACTGA TACTCAATGC 181 TTCTTCAAGA ACATTGAACG ATTTGAGAAA TTCTTGGGAA GATATGGGGA CGAATACGCC 241 ATGTCCCACA AGCAAAATTG TAACTGCCCC TTCCATCTCC ACCACACTTT TACTCCCTCA F2 301 GATAACGAGC ATCTGGTATC CTCTTTCGCA TTCGCCCGCC CAGAAGTCTC CATGGAAGAA 3
41、61 ATTAGAGCCA CACCCTATCA GGCCAACAAG CTTATTAGTG ACAAACATTA CGTGATGAAC 421 ATGTCCAAGA TCGATTCTAG AGTAACAGGA TCTTCCCTCC TTAAGAAGGT TAGCGAATGG 481 ACTGAAATGA GAATGAACTC CAACTTTAAT GGAACATTTG AACCATCAAG ACTCGCCCTC 541 TCCAACTCTG GCATGACAAC GGCAGGAGTC AACCTCGACG TTATTGTCAA ACCAAATAAT 601 GCAAGAAGTG TACTAG
42、GAAT ATTGGAATGT CATCGCCAGC ACGTGTGCAC CGCCGACGCC 661 AAGGGAACTG TCGCTTCAGC CATGCCAGCC GTCTTCCAGG CAACCGATGG AAACGGTAAC 721 GAATCTGAAC TGATCCAGAA TGCTCTGCCA AGGAACAGAT ACATCCAAAA GAGCACAATG 781 AACGCTCAAA CTGTCGTGTT TGCTAATGTT TTGGAACAAC TTATCGCCGA TCTTGGAAAG 841 GTTATCGTGAACGAACTGGC CGGCACCATC GCTGA
43、ATCTG TACCAGAAAG CGTATATGAA 901 AACACCAAGG AAATGATTGA TAGACTAGGC TCTGACGACC TCTTCAAATC TAATAATAAT 961 GGAGGAGTAG AATCAATGGA TTATGAAGAT AGCGAAACAA CATCCAACAA TGGTCCCGTC 1021 CTCATCTCAG AAGCCATGAA GAATGCCGTC TATCACACAC TAATTTCCGG CAAGGCAGCT 1081 CGCCCGGAAAATGTACCATT CGCCTCATGC GCCAGCGGCC CTCTCGCCTT TG
44、ATTTCCTT 1141 CTGTCAAAGG GAGATACATT CGAAGAAAAG AACGCCGAAC AAGGTGCAGC AGCTGCCGTA R2 1201 TCCTCTACCT ATTCTTCCTC TTCTAACACT ACTCTTCGTA AGCATTTGGC TCGAGTTTTC 1261 GAAGCCATCT CTAAGCAAGT AACTGATGCT GAATTCAAGG ATATCCTCAA CGATATCGAA 1321 CGTAATATTT CTTCTGACTA TACTAACTGT CCACCAAATA CTAACCAAAA TGCCTTTGCT 1381
45、 CTAGCTATCAAGAGAGAATT CAGCAGAATT GTTTCCTTCT TAACCATTCT TCGTAAGAAC 1441 A.TTACACCCG CATTA.GTCGA C Rl 14 NFON|N.03NH因。华人民共和国家标准白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分z套式PCR检测法GB/T 28630. 2-2012 国中华中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销善印张1.25 字数29千字2012年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年11月第一版华书号:155066 1-45621 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28630.2-2012 打印日期:2012年12月18日F008AOO
