1、ICS 65. 120 B 46 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 28715-2012 饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法Determination of acidic and neutral protease activity in feed additives- Spetrophotometric method 2012-09-03发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2013-02-01实施发布GBjT 28715-2012 目。昌本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SACjTC76)归口。
2、本标准起草单位:农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心(杭州i)、浙江大学饲料科学研究所、武汉新华扬生物有限公司。本标准主要起草人z王小驷、柳爱春、邹晓庭、吴琪、赵芸、朱加虹、陈小丽、周樱、谢红云。I 1 范围饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法本标准规定了饲料添加剂酸性和中性蛋白酶活力的测定方法。GB/T 28715-2012 本标准适用于饲料添加剂酸性、中性蛋白酶产品中酶活力的测定，以及复合酶产品中中性蛋白酶活力的测定。本标准定量限为500U/g(U/mL)。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不
3、注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 酸性、中性蛋白酶活力单位acidic and neutral protease active unit 在一定温度(40.C :l: O. 2 .C)和相应的pH条件下(酸性蛋白酶pH3.0，中性蛋白酶pH7.2)，在1 min内水解酷蛋白产生相当于1g酣基氨基酸(由醋氨酸等同物表示)的酶量，为1个酶活单位，以U表示。4 原理蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酷蛋白底物产生含有酣基的氨基酸(如:酷氨酸、色氨酸), 在碱性条件下，可将
4、福林试剂(Folin)还原，生成铝蓝与鸽蓝，其颜色的深浅与酣基氨基酸含量成正比。通过在680nm测定其吸光度，得到酶解产生的酣基氨基酸的量，进而计算蛋白酶活力。5 试剂和材料除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682规定的二级水。5. 1 碳酸铀溶遭C(Na2C03) = O. 4 mol/LJ 称取无水碳酸铀(NaZC03)42.4g，用水榕解并定容至1000 mL。5.2 三氯Z酸溶液c(CCI3-COOH)=0. 4 mol/LJ 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL. 1 GB/T 28715-2012 5.3 盐酸语班c(HCI)= 1 m
5、oI/LJ 取浓盐酸85mL，加水稀释并定容至1000 mL，即为1mol/L盐酸洛液。5.4 盐酸溶班c(HCI)= O. 1 moI/LJ 取100mL 1 mol/L盐酸溶液(5.3) ，定容至1000 mL，即为0.1mol/L盐酸溶液。5.5 氢氧化铀溶液c(NaOH)= 0.5 moI/LJ 取氢氧化铀20g，加水稀释并定容至1000mL，即为0.5mol/L氢氧化铀溶液。5.6 福林(Folin)试剂于2000mL磨口回流装置中加入鸽酸铀(Na2W04 2H2 0) 100.0 g、铝酸铀(Na2Mo04.2H20) 25.0 g ,7.)( 700 mL、85%磷酸50mL、浓
6、盐酸100mL。小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加人硫酸锺(Li2S04)50g，水50mL和数滴浓澳水(99%)，再微沸15mi丑，以除去多余的澳(冷却后仍有绿色需再加澳水，再煮沸除去过量的澳)，冷却后加水定容至1000 mL。混匀、过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用时，以1份福林(Folin)试剂与2份水混匀，制成稀福林(Folin)试剂。5. 7 乳酸缓冲液(pH3.0，适用于酸性蛋白酶)3 d o 甲液z称取10.6g乳酸(85%90%)，加水稀释并定容至1000 mL。乙液z称取16g乳酸铀(70%)，加水稀释并定容至1000 mL。使用榕液:取4份甲液，加乙液
7、(约1份)调整pH至3.0士0.05，此溶液在4.C冰箱贮存，有效期为5.8 磷酸缓冲液(pH7.2，适用于中性蛋白酶)分别称取磷酸氢二铀(Na2HP04)2.34 g和磷酸二氢铀(NaH2P04 2H20) 1. 00 g，用水溶解，用0.1 mol/L盐酸溶液(5.的或0.5mo1/L氢氧化铀溶液(5.日，单向调整pH至7.2土0.05，并定容至1 000 mL，备用。5.9 1%酷蛋白语液5.9.1 1 %酸性酷蛋白溶液(pH3.0)准确称取酷蛋白1)1. 000 g，先用约0.5mL浓乳酸湿润后，再加入乳酸缓冲液(5.7)约80mL，在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全榕解，冷
8、却后，用0.1mol/L盐酸榕液(5.4)或0.5mol/L 氢氧化铀潜液(5.日，单向调整pH至3.0:1:0.05，并转入100mL容量瓶中，用乳酸缓冲液(5.7)定容至刻度。此溶液在4oC冰箱贮存，有效期为3do 5.9.2 1 %中性酷蛋白溶液(pH7.2)准确称取酷蛋白1)1. 000 g，先用约0.5mL氢氧化铀潜液(5.5)湿润后，再加入磷酸缓冲液(5.8)约80 mL，在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/L盐酸椿液(5.4)或0.5mol/L氢氧化铀榕液(5.5)，单向调整pH至7.2士0.05，并转人100mL容量瓶中，用磷酸缓冲液(5.
9、的定容至刻度。其余同5.9.1.2 1) 标准使用的酷蛋白由中国药品生物制品检定所提供。给出这一信息是为了给使用者提供一个相对标准，如果其他产品能有相同的效果，则可以使用等效产品。5.10 L-酷氨酸标准物质纯度注95%。5. 11 L-醋氨酸标准储备语渡GB/T 28715-2012 精确称取预先于105.C干燥至恒重的L酷氨酸标准物质0.1000g，用20mL 1 mol/L盐酸溶液(5.3)溶解后，再用蒸悟水定容至100mL，即为1mg/mL L-酶氨酸标准储备溶液。5. 12 L-醋氨酸标准溶谊临用前，准确吸取10.0mL 1 mg/mL醋氨酸标准储备溶液(5.11) ，用0.1mol
10、/L盐酸溶液(5.4)定容至100mL，即得到100g/mLL-酷氨酸标准溶液。6 仪器与设备除常用实验室仪器设备外，应有下述仪器设备:6. 1 分光光度计z波长范围350nm800 nmo 6.2 pH计:精度为O.OlpH单位。6.3 分析天平:感量0.0001 g和0.01go 6.4 恒温振荡水浴锅(或普通水洛锅):精度为士0.2.C。6.5 秒表或定时钟。7 分析步骤7. 1 标准曲线绘制分别准确吸取100g/mLL-酷氨酸标准溶液0.00mL、1.00 mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00 mL和6.00mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制成每毫升分
11、别含L-酷氨酸0.0阅、10.0月、20.0阅、30.0阅、40.0阅、50.0阅和60.0问的标准工作溶液。分别吸取L-醋氨酸标准工作溶液1.0 mL，加5.0mL碳酸铀溶液(5.1)和1.0 mL稀福林(Folin)试剂(5.的，于具塞试管中(每个浓度做2个平行)，混匀。将标准管同时置于40.C水浴，反应20min，取出，置于冷水中，迅速冷却至室温，用10mm比色皿，以空白管调仪器零点，在分光光度计波长680nm处测吸光度。以L-酶氨酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。回归系数(r2)在0.9978以上时，方可使用，否则应重做。新配制的福林(Folin)试剂应
12、制作新的标准曲线。7.2 试样制备7.2. 1 渍体酶试样的制备根据样品酶活力大小，吸取适量的液体酶液，酸性蛋白酶试样用乳酸缓冲液(5.7)中性蛋白酶试样则用磷酸缓冲液(5.8)J稀释至酶活力约为5U/mL20 U/mL，待测。7.2.2 固体酶试样的制备将试样粉碎或充分碾碎，过孔径为0.25mm筛。根据样品酶活大小，称取O.2 g2 g样品，精确至GB/T 28715-2012 0.001 g，置于250mL锥形瓶中，酸性蛋白酶试样准确加入100mL乳酸缓冲液(5.7) 中性蛋白酶试样则加入磷酸缓冲液(5.8)J，搅拌使试样充分混匀，30.C 100 r/min振荡水洛(或用普通水浴锅，每5
13、min 搅拌1次)，水浴提取30min，摇匀，用中速定性滤纸过滤。滤液用乳酸缓冲液(5.7)中性蛋白酶试样则用磷酸缓冲液(5.8)J，稀释至酶活力约为5U/mL20 U/mL，推荐的样品第二次稀释倍数见表10表1推荐样品第二次稀释的倍数样品酶活/CU/mL或U/g)5 000 5 000-50 000 50 000-100 000 二三100000 稀释倍数1 10 20 50 7.3 测定步骤取三支10mL具塞试管(一支样品空白管，两支样品管)，分别向三支试管中准确加人稀释好的待测酶液各1.0 mL，将试管放入40.C士0.2.C水浴中预热5min，向两支样品管中加入1.0 mL经同样预热的
14、1%酷蛋白溶液(5.的，准确计时反应10min，迅速、准确地向三支试管中加入2mL 0.4 mol/L 三氯乙酸榕液(5.2) ，于样品空白管中加人1.0 mL 1%酷蛋白溶液(5.的，摇匀。将三支试管继续置40.C土0.2.C水浴中放置10min，取出，迅速冷却至室温，并用中速定性滤纸过滤。另取三支10mL具塞试管(一支样品空白管，两支样品管)，分别吸取上述相应的滤出液1.0 mL加入三支试管中，各加人5.0 mL O. 4 mol/L碳酸铀榕液(5.1)、1.0 mL稀福林(Foiln)试剂(5.的，摇匀，水洛40.C :1: 0.2 .C中放置20min，取出置于冷水中，迅速冷却至室温。
15、用水代替滤液做试剂空白，以试剂空白管调仪器零点，在分光光度计波长680nm下，用10mm比色皿，分别测定样品空白管和样品管中样液的吸光度，将样品管与样品空白管吸光度之差取平均值，通过线性回归方程求出生成的酷氨酸的浓度。8 结果计算与表示8. 1 结果计算4 样品中酸性或中性蛋白酶活力以Xi表示，按式。)计算:式中zX一(C- co) x V X 4 X N -1. 0 X m X 10 Xi一一蛋白酶活力，单位为酶活单位每克(U/g)或酶活单位每毫升(U/mL); c 样品管的酷氨酸浓度，单位为微克每毫升(g/mL); Co 样品空白管的酷氨酸浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V一二固体酶
16、试样提取液的总体积或液体酶试样第一次稀释总体积，单位为毫升(mL);N一一样品提取液第二次稀释的倍数F4 酶反应体系总体积，单位为毫升(mL);1.。一一参与反应的酶量，单位为毫升(mL);m一一试样质量或体积，单位为克(g)或毫升(mL);10 反应时间，单位为分钟(min)。. ( 1 ) GB/T 28715-2012 8.2 结果表示以平行样的平均值为最终的酶活力测定值，计算结果保留整数位。9 重复性试样应至少取两份平行样进行重复测定，平行样的相对标准偏差不超过10.0%。5 N-ON|-hNH回。华人民共和国家标准饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法GB/T 28715 2
17、012 国由a争中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数10千字2012年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年11月第版峰书号:155066. 1-45781 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28715-2012 打印日期:2012年12月18日F008AOO
