1、中华人和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1071-2014 代替SN/T1071-2002 出口食晶中厌氧亚确酸还原梭状芽子包杆菌检测方法Method for the determination of anaerobic sulfite-reducing clostridia in food for export 2014-01-13发布2014-08-01实施一均田比V叫阳工笠mEAAVFJZ 中华人民共和睦发布国家质量监督栓验栓痊总局噩1 SN/T 1071-2014 自E吕本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1071-2002(进出口食品中厌氧亚硫酸盐还
2、原梭状芽胞杆菌检验方法。本标准与SN/T1071-2002相比，主要技术变化如下:将原标准名称进出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽胞杆菌检验方法修改为出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌检测方法); 一一增加了规范性引用文件;修改和规罩了设备和材料;一一增加了非冷冻而易腐蚀的样品的采集、贮存和运输，及样品制备的方法;增加了平板计数法中的分别吸取1mL空白稀释液加入两个元菌平皿内做空白对照;增加了平板计数法中结果计算的举例;一一一将平板计数法中的数值单位/gCmL)修改为CFU/gCmL);将最近似值CMPN)法中的数值单位/gCmL)修改为MPN/gCmL);一一附录A中增加了2%无菌琼脂的成
3、分和制法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:曹际娟、王金玲、张莹、徐君怡、李俊环。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:SN/T 1071-2002。I 1 范围出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌检测方法本标准规定了出口食品中庆氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌检测方法。本标准适用于出口食品中2 术语和定义2.1 SN/T 1071一2014厌氧亚研酸盐还原梭状芽抱一群厌氧、过氧化氢酶阴性食品加工设备、食品生产环境等氏阳性梭状芽抱杆菌。是食品、水、3 设备和材料3.1 冰箱:2C5 C。3.2 恒温水浴箱:50 C
4、:f: 1 C 3.3 恒温培养箱:36 C :f: 1 3.4 天平:感量0.1g。3.5 均质器及均质杯或均质3.6 厌氧条件及相关设备:、备中放入厌氧袋，也可在庆氧3.7 3.8 元菌培养皿:直径90mm。3.9 元菌试管:15mmX150 mm。3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。4 培养基和试剂4.1 氧化铀膜蛋白陈稀释液:见附录A中A.1，4.2 亚硫酸铁琼脂:见A.2。4.3 启肉培养基:见A.3。4.4 3%过氧化氢榕液:使用前配制。4.5 缓冲甘油一氧化铀榕液:见A.4，4.6 2%元菌琼脂:见A.5。封盒中，或其他保持厌氧条件的设飞，器及吸头。SN/T 1071-2
5、014 5 样品的贮存和运输5.1 冷冻样品，如不能立即进行检验，应置于18c保存。5.2 非冷冻而易腐蚀的样品，元菌操作称取25g( mL)样品加入25mL元菌缓冲11油氧化饷榕液(液体食品应加双料)，并尽快放入2C 5 c冰箱保存。5.3 运送样品时，应采取措施.防止样品中微生物数量和性质发生变化。6 样品制备将冷冻样品在115C以下不超过15min，或2C5 C不超过18h解冻后进行检验。以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL氧化饷膜蛋白陈稀释液的灭菌均质杯或无菌均质袋内(女11为5.2中样品，加入200mL氧化rlJ!民蛋白胀稀释液)，于8000 r/min 10 000 r/m
6、in均质1min2 min或m拍击式均质器拍击1mi口，制成1: 10样品匀液。如为液体样品，则无菌操作移样25mL，加入装有225mL 氧化纳膜蛋白陈稀释液的灭菌玻璃瓶中(如为5.2中样品，加入200mL氯化饷膜蛋白陈稀释液)，充分捏匀后，制成1: 10样品匀液。根据样品污染情况做进一步的系列10倍递增稀释。若检测庆氧亚硫酸盐还原梭状芽J包杆菌的芽J包，可对1: 10样品匀液进行75C 20 min或煮沸保持10min热处理，之后以流水迅速冷却至室监后再做进一步的系列10倍递增稀释。7 检验步骤与计算7.1 平板计数法7. 1. 1 适用于检验未经加工处理的生鲜食品及厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱
7、杆菌10CFU/g(mL)的食品。7. 1.2 选适宜的三个连续稀释度，从每个稀释度分别吸取1mL稀释样液于无菌培养皿l内，每个稀释度做两个平血。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个元菌平m内做空白对照。7. 1. 3 及时将约15mL冷却至50C的亚硫酸铁琼脂培养基(可放置于50C土1C恒温水陆箱保惺)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个平皿，所用的时间不应超过15min。7.1 .4 待?昆合物凝固后，再倾注10mL 2%元菌琼胳于己凝固的培养基上作为隔层。7. 1. 5 待该隔层凝固后，将制备好的平板于36C士1C厌氧培养24h48 h。若对培养
8、温度有特殊要求(如46C)，可根据情况进行培养。7. 1. 6 厌氧亚硫酸盐还原梭状芽于包杆菌在亚硫酸铁琼脂上呈黑色菌落。7.1.7 从计数的平板(具20个200个菌落)中任取10个典型菌落，分别取培养物按9.1和9.2进行证实试验。对阳性结果进行计数。7. 1. 8 平板典型菌落数乘以证实为厌氧亚硫酸盐还原梭状芽面杆菌菌落所占比例，再乘以样品稀释倍数即为样品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌的计数，报告为厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌CFU/gCmL)。例如:在10-1样液的两个平板中分别有85个和80个菌落，而确认在10个菌落中分别有8个和4个为厌氧亚硫酸盐还原梭状芽咀杆菌，那么每克或每毫升食品
9、的厌氧亚硫酸盐还原梭状芽面杆菌数为C85X8/10十80X4/10)/2X10=500。7.2 最近似值CMPN)法7.2.1 适用于检验含有受损伤的厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌的加工食品及厌氧亚硫酸盐还原梭SN/T 1071-2014 状芽于包杆菌10CFU/g(mL)的食品。7.2.2 选适宜的气个连续稀释度.从每个稀释度巾分别吸取1mL稀释样液，接种于3管装有自肉培养基的试管巾，36C士1C厌氧培养24h72 h待出现生长特征(培养液混浊、产气、出现异|床)后-进行分离培养(HP :按照7.2.3进行培养)。反之.则按阴性结果计数。7.2.3 吸取7.2.2IlH见生长特征性的增菌培养物
10、1mL分别置于元菌培养血中.将约15mL 46 C的亚硫酸铁琼脂(可放置于46c土1c愤温水浴箱保泪)倾注:平l1IL，并转动平nTI使其混合均匀.待其凝阳后.再倾注10mL同样的培养基作为隔层.于36C士1C厌氧i市养21h48 h。若生成黑色菌落，则取各培养血中的典型菌落按8.1和8.2加以证实:若无黑色菌落生成，则按阴性结果计数。7.2.4 最近似值(MPN)的估算应计数每个稀释样液得到的阳性反应管数。根据反应阳性管数查阅MPN检索表(见附录白，得出样品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌最近似值，报告为厌氧亚硫酸盐还原梭状芽而杆菌MPN怡(mL)。8 证实试验8.1 形态观察取可疑菌落涂片，
11、做革兰氏染色，镜检.检查培养物细菌形态。厌氧亚硫酸盐还原梭状芽于包杆菌为革兰氏阳性的梭状芽J包杆菌。产芽于包时，芽子包呈卵圆形或球形，位于中央、次终端。8.2 过氧化氢酶试验在洁净载玻片上滴l滴培养物，再滴1声I2滴3%的过氧化氢府液，于0.5min内观察出现小气泡说明有过氧化氢酶活性。厌氧亚硫酸盐还原梭状芽于包杆菌不产生过氧化氢酶。3 SN/T 1071-2014 附录A (规范性附录)培养基和试剂A.1 氯化铀膜蛋白服稀释液A.1.1 成分膜蛋白陈氧化铀(NaCl)蒸馆水A.2.1 成分膜蛋白陈大豆蛋白陈酵母浸音偏重亚硫酸铀(Na2S20S)拧棱酸铁镀(NR1)3 FeC 琼脂蒸f留水A.
12、2.2 制法将以上成分?昆合加热溶fA.3 启肉培养基A.3.1 成分牛肉浸液1 000.0 mL 蛋白陈30.0 g 酵母浸音5.0 g 磷酸二氢铀(Na2H2P04) 5.0 g 葡萄糖3.0 g 可溶性淀粉2.0 g 碎肉渣适量A.3.2 制法取碎肉渣分装15mmX 150 mm试管，高约2cm3 cm，将上述液体培养基分装至每管内超过肉4 SN/T 1071一2014j奋表而约1cmo J-_面覆盖融化的凡士林或液体石蜡0.3cmO.4 cmo 121 oc高压灭菌15mi日。A.4 缓冲甘油-氧化铀溶液A.4.1 成分氧化饷(NaCD 无水磷酸氢二押(K2HP(),) 元水磷酸二氧j
13、l(KH2PO，) 甘油蒸t留水A.4.2 制法4.2 g 12 .4 g iLO g 100.0 mL 900.0 mL 将以上成分出合加热j容化，调节p日至7.2.1210C高压灭菌15ri.i口。配制双料缓冲1-1-1油i容液(20 %)时，用t=I-Yl200 mL和蒸馆水800mL。A.5 2%无菌琼脂A.5.1 成分琼脂蒸tE1水A.5.2 制法2.0 g 100.0 mL 将以上成分混合加热济化.121oC高压灭菌15mi口。3 SN/T 1071-2014 附录B(规范性附录)1 g(mL)检样中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌最近似值(MPN)表使用三管法，接种量分别为0.1g
14、, O.Ol g , O.OOl g(见表B.l)。表B.1 1 g(mL)检样中厌氧亚破酸盐还原梭状芽抱杆菌最近似值(MPN)表阳性管数阳性管数MPN MPN 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 。3 2 。9.1 。1 3 2 。l 14 。2 6 2 。2 20 。3 9 2 。3 26 。1 。3 2 1 。15 。1 1 6.1 2 1 l 20 。l 2 9.2 2 l 2 27 。1 3 12 2 l 3 34 。2 。6.2 2 2 。21 。2 1 9.3 2 2 1 28 。2 2 12 2 2 2 35 。2 3 16 2 2 3 42 。3 。9
15、.4 2 3 。29 。3 1 13 2 3 1 36 。3 2 16 2 3 2 44 。3 3 19 2 3 3 53 1 。3.6 3 。23 1 。1 7.2 3 。1 39 1 。2 11 3 。2 64 1 。3 15 3 。3 95 1 1 。7.3 3 l 。43 1 1 1 11 3 l l 75 1 2 15 3 1 2 120 1 l 3 19 3 1 3 160 l 2 。11 3 2 。93 l 2 1 15 3 2 150 l 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 l 3 。16 3 3 。240 1 3 1 20 3 3 1 46
16、0 1 3 2 24 3 3 2 1 100 1 3 3 29 3 3 3 1 100 注，:本表采用3个稀释度0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g( mL) J，每个稀释度接种三管。注2:表内所列检样量如改用1g( mL)、0.1g(mL)时，表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)和0.001 g(mL)和0.0001 g( mL) 时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。6 2日-EOFH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽抱杆菌检测方法SN/T 1071-2014 争f中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室，(010)68533533网址.c口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各印张0.75字数12千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元?飞毛书号，155066 2-27760 SN/T 1071-2014
