1、华人民共和圄出入境检验检疫行业标准SN/1632.3-2013 代替SN/T1632.3 2005 出口奶粉检验方法阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)第3部分:荧光PCR方法Determination of Enterobacter skzakii (Cronobacter spp.) from dehydrated powdered milk for export-Part 3: Real-time PCR method 2013-11-06发布2014-06-01实施_IS轨至00-沪lif-、e一嗡一协.飞、-节M5C(如n阴如:必如s中华人民共和自发布匪家质量监督检验检疫总局SN/T 1632
2、.3一2013自日-品E习SN/T 1632(出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法共分为3个部分:一一第1部分:分离与计数;一一第2部分:PCR方法;第3部分:荧光PCR方法。本部分为SN/T1632的第3部分。本部分依照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1632.3-2005(奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分:荧光PCR方法。本部分与SN/T1632.3-2005相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下:一一修改了标准的中英文名称;修改了引物和探针;一一删除了定义、术语和缩略语;一一-增加了克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法的资料性附录。请注意本文件的某些内容可能涉
3、及专利。本文件的发布机构不承扭识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人:赵贵明、王姆、吕敬章、陈颖、杨海荣、赵勇胜、高旗利、张霞、刘培。本部分所代替标准的历次版本发布情况为:一-SN/T1632.3一2005。I SN/T 1632.3-2013 出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法1 范围SN/T 1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)的荧光PCR检测方法。本部分适用于奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺
4、杆菌属)的快速定性检测，其他食品可参照执行。2 规范性引用文件SN/T 1632.2-2013出口奶粉3 测定方法3.1 方法提要奶粉经增菌后，取增菌液1mL 倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干(使用前室温解冻并充分混匀，快上清被作为模板进行荧光PCR诺杆菌属)进行快速检测。3.2 试剂和材料见SN/T1632.1。除另有规定3.2.1 引物:5-GGCGAGCGGCGAATATTAT -3 5人CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC -3 3.2.2 探针:5 -FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-3 , 3.2.3 Ex Taq DNA聚合酶。3.2.4 dNT
5、Ps: dA TP、dTTP、dCTP、dGTPo3.2.5 DNA提取试剂:0.1%Chelex100C整合树脂)水溶液。件，仅注目期的版本适用于本文o r/min的转速离心5min，轻轻吸干;加入50LDNA提取液o r/mi口的转速离心5min，取对奶粉中的阪崎肠杆菌(克罗3.2.6 10 X PCR缓冲液:200mmol/L Tris-HC1CpH 8.的，200mmol/L氯化挥，15mmol/L氧化镜。3.2.7 FastSartUniversal Probe MasterC2 X)。3.2.8 阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)质控菌株:A TCC 29544，或等效菌株。3.2.9 仪
6、器和设备。3.2.10 荧光PCR仪。SN/T 1632.3-2013 3.2.11 离心机:20000 r/mino 3.2.12 移液器:10L、100FL，200L、1000L。3.2.13 水浴锅。3.3 操作步骤(流程见附录A)3.3.1 前增菌和增菌取检样100g加入已预热至450C装有900mL灭菌水的锥形瓶中，振摇使样品充分洛解，36oC士1 oC培养18h22 h。移取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐膜蛋白陈肉汤中(MLST，见SN/T 1632.2-2013中A.1), 36 oC:!: 1 oC培养18h22 h。3.3.2 模板DNA准备每瓶培养的MLST分别取1m
7、L加到1.5mL元菌离心管中，8000 r/min离心5min，轻轻倒去上清液，但j置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干;加入50LDNA提取液(使用前室温解冻并充分?昆匀，快速吸取)，1昆匀后沸水浴5min , 12 000 r/min离心5mi口，取上清液以待检验(如不能及时检验，可将上清液于一20oC保存)。也可使用其他经验证的DNA提取方法。3.3.3 荧光PCR检测反应体系总体积为25L，其中含:上游引物和下游引物(10mol/L)各0.4FL, FastSartUniversal Probe Master(2X )12.5L、探针(10mol/L)0.2L、模板D
8、NA2L，也iHzO补齐至25L反应步骤:反应步骤一，95oC10 min;反应步骤二，950C5 s , 55 oC退火20s，同时收集荧光信号，共进行40个循环。反应产物可在4oC保存。检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆菌和大肠杆菌到10mL NB中，36oC士1oC过夜培养，各取1.5mL增菌液，离心，提取DNA模板。阪崎肠杆菌DNA模板作阳性对照，大肠杆菌DNA模板作阴性对照，空白对照以元菌水作为模板，加样量与样品加样量一致。4 结果与报告4.1 检测样本Ct值小于或等于35.0时，报告阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)筛选阳性;检测样本Ct值大于35.0且小于40.
9、0时，重复一次，如果c值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)未检出;样本检测不到c值时，报告阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)未检出。4.2 筛选阳性的样本按SN/T1632.1进行确证，必要时参考附录B方法，进一步区分到种。4.3 报告每100g样品中检出或未检出阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)。2 SN/T 1632.3-2013 附录A(规范性附录)荧光PCR检测方法程序检样100g+无菌蒸馆水900mL36 C :I: 1 C , 18 h22 h 1 mL+10mL改良月桂基硫酸盐膜蛋白陈肉汤(MLST肉汤)36C士
10、1C , 18h22 h 荧光PCR检测阴性阳性克罗诺捋菌显色翁养l基:6士1l ，18h22h 膜化大豆蛋白琼脂平板(TSA)25 C :I: 1 C , 48 h72 h 氧化酶试验，革兰氏染色，生化鉴定报告E 图A.1程序图3 SN/T 1632.3-2013 附录B(资料性附录)克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法B.1 测试样品基因组DNA的制备实验菌株纯培养物经36oC 24 h增菌后，取增菌液1mL加到1.5 mL无菌离心管中，以8000 r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干;加入50LDNA提时榻黯蹄蟠蕴瀚糕搓勤揭露结
11、毅磁吸取)，混匀后沸水浴5min，以12 000 r/min的转速离心5min, B. 2 引物引物见表B.L基因名称recN B.3 聚合酶链式反应采用表B.1中的引物对检测(含Mg2+)2.5L，dNTPs(各2引物(10mol/L)各0.5L，预变性5min , 95 oC变性30s , 5 延伸，40C保存。B. 4 产物鉴定及泪.u序扩增片段长度/bp1 800 反应体系中，10X PCR buffer erase(5 U/L) 0.2L，上下游。PCR循环反应参数为，95oC 配制2%琼脂糖凝胶，取5LPCR产物加澳酣蓝j昆匀，加入合适的DNA分子量标记物，根据电泳槽的长度设定合适
12、的电压进行电泳。凝胶经GelRed染色后，用凝胶成像系统成像，分析PCR反应结果，然后将阳性PCR产物纯化，送至上海生工进行克隆测序。B.5 聚类分析将测序结果拼接后，选取其中的1662bp进行多序列比对，用Mega4.0进行聚类分析。同时以GeneBank上已经公布的克罗诺杆菌属不同种的renN基因序列作为阳性参考:C. dublienszs (EU569474) , C. genomosecies 1 (EU5694 79) , C. muytjensii (EU569492) , C. turicensis (EU569523) , C.sakazakii (EU569522)、C.ml
13、onaticus(EU569491)。4 SN/T 1632.3-2013 B.6 结果判定聚类分析中，将测序结果拼接后，用Lasergene软件选择其中最长的一个ORF1662bpC从起始密码子ATG开始到终止密码子结束)，或与参考序列C.dublinesis(EU569474)等比对，截取等长的片段1662 bp，与GeneBank中的参考序列进行blast比对，同源性大于97%时，可判断为同一种菌。D 已ONi的.N的HZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法SN/T 1632.3-2013 * 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市商城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)64275323网址中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷.x-印张0.75字数12千字2014年6月第一次印刷开本880X1230 1/16 2014年6月第一版印数1-1600 定价16.00元只书号:155066 2-26966 SN/T 1632.3-2013
