1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜主要食用菌中转基因成分定性犘犆犚检测方法犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狋犺犲狇狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀（犘犆犚）犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狀犵犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱犮狅犿狆狅狀犲狀狋犻狀犳犪犿犻犾犻犪狉犲犱犻犫犾犲犳狌狀犵犻发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈文炳、邵碧英、江树勋、李寿崧、朱晓南、郭立新、杨婕。本标准系首次发布的出入
2、境检验检疫行业标准。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售主要食用菌中转基因成分定性犘犆犚检测方法范围本标准规定了主要食用菌中转基因成分检验的抽样、制样、定性检测方法。本标准适用于对主要食用菌（杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双孢蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇、金顶侧耳、茶树菇、竹荪、黑木耳、白木耳等）中转基因成分的检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的
3、引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和实验方法（，：）植物及其加工产品中转基因成分实时荧光定性检验方法缩略语下列缩略语适用于本标准。犖犗犛狀狅狆犪犾犻狀犲狊狔狀狋犺犪狊犲犵犲狀犲犳狉狅犿犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶基因。犅犃犚狆犺狅狊狆犺犻狀狅狋犺狉犻犮犻狀犪犮犲狋狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲犵犲狀犲犳狉狅犿犅犪犮犻犾犾狌狊犪犿狔犾狅犾犻狇狌犲犳犪犮犻犲狀狊来源于杆菌犅犪犮犻犾犾狌狊犪犿狔犾狅犾犻狇狌犲犳犪犮犻犲狀狊草丁膦乙酰转移酶基因。犌犝犛犵犾狌犮狌狉狅狀犻犱犪狊犲犵犲狀犲葡糖醛酸酶基因（作为植物基因表达的报告基因）。犖犘犜狀
4、犲狅犿狔犮犻狀狆犺狅狊狆犺狅狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲犵犲狀犲来自大肠杆菌菌株的新霉素磷酸转移酶基因。犛狉犇犖犃编码（核糖体）的。原理样品经过提取后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过技术，对外源基因的片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照规定的一级水。缓冲液：，（），（）。饱和酚或水饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。异丙醇。无水乙醇。乙醇。溶液（，）。（）。蛋白酶（）。琼脂糖：电泳纯。三羟甲基氨基甲烷（）。氯化钠溶液（）。（）：乙二胺四乙酸。
5、缓冲液（含氯化镁）。溶液：，各。犜犪狇聚合酶。引物：检测转基因食用菌内、外源基因的引物序列及相关信息见表。表犘犆犚引物与犘犆犚产物基因名称基因来源引物序列扩增长度退火温度提示内源外源终止子外源目的基因外源报告基因外源标记基因研究转基因食用菌用的阳性质粒，含有终止子、香菇三磷酸甘油醛脱氢酶（）基因启动子、目的基因、报告基因等元件，从中提取溶液。溴化乙锭（）：。分子量标准。缓冲液：，硼酸，（）加蒸馏水至。加样缓冲液（电泳前沿指示剂）：溴酚蓝，二甲苯青，甘油水溶液（或蔗糖）。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售离心管：，两种规格，用前须高压灭菌处理。反应管：，用前须高压灭菌处理。仪器设备研钵或电
6、动研磨器。恒温水浴锅或干式恒温器：恒温范围为室温，精度为。电子天平：感量为与。台式高速离心机，低温冷冻高速离心机，小型瞬时离心机。高温干燥箱。冷冻、冷藏冰箱。制冰机。旋涡振荡器。高压灭菌锅。计。微量移液器：体积范围为，枪头用前应高压灭菌处理。浓缩仪。核酸蛋白分析仪。纯水机。超净工作台或生物安全柜。仪。微波炉。电泳仪。电泳槽。凝胶分析成像系统。测定方法犇犖犃的抽提及浓度测定犇犖犃的提取称取约烘干后的食用菌样品，经干热灭菌（干热处理）或、高压消毒处理的研钵或在粉碎机中研磨成颗粒大小约左右的粉末，备用。称取烘干后研磨成粉的样品于的离心管中，加缓冲液，蛋白酶（），（），剧烈振荡以上，温浴，期间定期振荡
7、。加水饱和酚三氯甲烷异戊醇（），剧烈振荡，犵离心。取上清液，再加等体积的水饱和酚三氯甲烷异戊醇（），振荡混匀，犵离心。取上清液，加倍体积异丙醇，混匀，犵离心。取沉淀，加入氯化钠（）于温浴中溶解，加等体积的水饱和酚三氯甲烷异戊醇（），振荡，犵离心。取上清液，加倍体积的无水乙醇，轻微振荡，犵离心。取沉淀，乙醇清洗次，干燥，加（）溶解。每个样品设个重复。也可使用市售的应用于真菌提取的试剂盒。犇犖犃的浓度与纯度测定方法样品用核酸蛋白分析仪测定和处吸收值，分别计算纯度与浓度，纯度等于，比值在之间较为理想。双链浓度（）等于倍值。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售方法通过真核生物共有的核糖体基因的扩增
8、结果，判定从样品中提取的是否适合于检测，测试步骤按规定的方法。定性犘犆犚检测犘犆犚反应体系检测食用菌中的内源基因与外源基因采用的检测体系见表。每个样品反应体系设个重复（同时做管）。表定性犘犆犚检测参考反应体系试剂名称储备液浓度反应体系加样量反应体系加样量缓冲液（含氯化镁）犜犪狇酶正向引物反向引物模板双蒸水（）补至补至犘犆犚反应体系对照的设置进行检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的。阴性对照：非转基因食用菌中提取的。空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。犘犆犚反应热循环参数的设置预变性。变性，退火，延伸，个循环。延伸。下保存。也可
9、根据不同的基因扩增仪对反应热循环参数做相应的调整。犘犆犚扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液制备的琼脂糖凝胶。将的扩增产物分别与的加样缓冲液（电泳前沿指示剂）混合后，在凝胶板上的孔中点样。用分子量大小适当的做分子量标记。选择合适的电压（），电泳时间为。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。结果判断样品犇犖犃抽提质量判断按照真核生物共有的核糖体基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的提取液进行扩增。均应扩增出的片段，否则，说明提取的质量有问题，或者是溶液中存在反应的抑制因子，应该重新纯化或提取，直至扩增出该片段，防止检测中产生假阴性结果。外源基因的检测如果阴性对照与空白对照未扩增出片段，阳性对
10、照扩出预期的片段，待测样品未扩增出预期的片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的片段，则可初步判定犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。结果确证实验与结果表述方法实时荧光犘犆犚检测方法待测样品外源基因扩增阳性结果的，按照中规定的方法执行。方法犘犆犚扩增产物的犇犖犃测序方法外源基因扩增阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与已知的该外源基因相应序列进行比对加以确证。注：可根据实验室条件任选一种方法进行确证。结果表述经或确证为阳性的，表述为：检出基因；确证为阴性的，表述为：未检出基因。样品保存保存条件干燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于下。保存期限保存期限为个月。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准主要食用菌中转基因成分定性犘犆犚检测方法中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售
