1、GB/T 5413.25-1997 前言本标准等同采用美国公职分析化学师协会(AOAC)方法，测定的是具有生物效价的肌醇含量.本系列标准从实施之日起，代替GB5413-85. 本标准由中国轻工总会提出.本标准由全国乳品标准化中心归口.本标准负责起草单位g国家乳制品质量监督检验中心.本标准参加起草单位E卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢中菌投资服务有限公司.本标准主要起草人g张玉杰、王芸、房玉国、王克新.3ZZ 中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉肌醇的测定GB/T 5413. 25-1997 代替GB5413-85 Mllk powder and
2、formula roodo ror Infant and young chlldren -Determlnatlon of Inooltol 1 范围本标准规定了肌薄的测定方法.本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中肌醇的测定，方法二适于乳粉中肌醇的测定.方法一微生物法2 方法原理通过Saccharomycesuvarum的生长情况来评价肌醇的含量.3 试jIIIJ、菌种和培鼻基所有试剂，如未注明规格，均指分析纯a所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 盐酸B体积比为1: 1 将体积分数为37.%的浓盐酸50mL用水稀释至100mL.3. 2 氢氧化销，c(NaOH)为lmol
3、/L将40g氮氧化纳溶解于水中，稀释至1000mL.3.3 肌醇标祥g无水晶体.3.4 菌种Saccharomyces uvaru隅。3.5 培养基3. 5. 1 链子包霉菌琼脂培养基:3号蛋白栋栓，酵母浸膏始，麦芽糖4饨，琼脂15g.3.5.2 肌醇测定用培养基z葡萄糖100g.拧糠酸饵1饨，拧橡酸钮，磷酸二氢绑1.Ig.氯化饵0.85g.硫酸镇0.25g.氯化钙O.25g，硫酸锺50mg，氯化亚铁50mg，DL-色氨酸80mg，L-脱氨酸。.19.L异亮氨酸。.5日.L赖氨酸O.蚀，L-蛋氮梭O.蚀，DL-苯基丙氨酸。.2g ，L-酶氨酸。.钮，L-天门冬酣胶O.饨，DL天门冬氨酸O.2g
4、 ，DL-丝氨酸O.19，甘氨酸O.坛，DL苏氨酸O.饵，L-缴氨酸。.5g，L组氨酸。.12钮，L-脯氨酸O.栓，DL-丙氨酸。.佬，L-谷氨酸。.饨，L精氨酸O.48g，盐酸硫胶素500g.生物素16闸，泛酸钙5mg.盐酸毗哆醇lmg，加蒸馆水至1OOOmL ,pH5. 2士0.2(25C)。准批amu 饨，hJV nuu 及7尸棒仪1室局验。-实计一监E用H-术创常P一黝44-E 1998-09-01实施323 GB/T 5413.25-1997 4.2 250mL圆底烧瓶，与冷凝器连接的锥形玻稿接头。4.3 比色仪.5 样品J备5. 1 贮备菌种的制备5. 1. 1 从纯菌种S.uva
5、rum中转接2个以上已制备好的麦芽浸出汁琼腊斜面。30(:培养16-24h。贮于冰箱中，保存期不要超过2周，然后再转摸到新的琼脂斜面上。5. 1. 2 接种的准备最好在使用的当天从贮备菌种中转接到新配制的麦穿浸出汁琼脂斜面上.30C培养16-24ho用接种环无菌地转接该菌种到一个灭菌生理盐水中，直到得到一定浓度菌体细胞的悬浮液.为了测寇，制备一个酵母菌悬浮水溶液，这个悬浮液中酵母菌的浓度在O.lmg/mL。分光光度计事先用水调到IJ100%透光率，然后测定这个标准酵母菌的透光率。将新接种斜面中的菌体细胞移入到无菌生理盐水中，其浓度直到达到与上述标准溶液具有相同的透光率为止。5.2 标准溶液5.
6、2. 1 标准贮备液，肌醇的浓度为0.2mg/mL。称取100mg肌醇(该肌醇标样已放在于燥楞中干燥24仙，于容量瓶中用水稀释至500mLo贮予冰箱。5.2.2 标准工作液，肌醇的浓度为2，.g/mL。吸取5mL(5.2. 1)溶液，用水稀至500mL.定容.当天都l备。6操作步骤6. 1 样品的处理6. 1- 1 干粉样品精确称取一定量样品，这些样品中约含肌醇O.5mg，移入250mL圆底烧瓶中，加100mL盐酸(1:1) (3. 1) .继续6.1.3步骤。6. 1. 2 液体样品。吸一定量样品，这些样品中约含肌醇0.5mg.:IJ日100mL盐酸(3.1).继续6.1.3步骤-6.1.3
7、 将装样品的圆底烧杯与冷凝器联结，经过仙，通过蒸馆将盐酸除去。将剩余物用蒸偏水冲到烧杯中，用lmol/L氢氧化销将溶液的pH值调至5.1土0.10稀释至250mL.过滤，弃去前部几毫升。这个溶液肌醇的浓度均为2g/mL。6.2 标准曲线接表1顺序加入蒸馆水、标准溶液于培养管中，一式三份.表1试管号No.l z 3 4 5 6 7 蒸偏水.rnL5 5 4 3 2 l 。棕攘瓣液.mL。1 2 3 4 5 一6.3 测定液按表2顺序加入蒸馆水、样品溶液于培养管中，一式三份。表2试管号No.1 2 3 4 蒸馆水.mL4 3 2 1 样品溶液，mL1 2 3 4 324 GB/T 541 3. 2
8、5-1997 6.4 热处理用棉塞或不锈钢帽盖住所，有试管，100C蒸汽蒸lOmino6.5接种冷却试管至30C以下。无菌添加接种物于基础贮备培养基中，以每100mL添加2mL的比例添加，充分混合，将上述已接种的培养基无菌加入到6.2和6.3的每个测定管中，每管加5mL(其中标准曲线中No.1号试管只加5mL未接种的培养基。6.6培养将试管固定在机械振荡器上，以每分钟振荡100-200次的往复运动中，28-30C之间选择个恒定温度(土O.5C)培养Z224h.6. 7测定从振荡器上取下试管，于100C蒸5min或每管加1滴杀菌Jl!J(Thoral) ，以使其停止生长。试管被任何外来微生物污染
9、则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是滑的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。充分混合每一个试管(也可以加滴消泡剂)，将反应液加到比色皿内，搅拌内容物，将比色皿放入到分光光度计的比色池内，波长为540-660nm，读出透光率或吸光度，稳定308，每个试管稳定时间要相同。对于未接种管，将其透光率调到tl100%(或吸光度为0)，读出其他接种空白管的读数。将接种空白管的透光率调到100%(或吸光度为0)，依次读出其他每个管.对每个水平的测试溶液，计算每毫升中维生素的含量，计算所得值的平均数，每个管测得值不得超过该平均值的士15%。如果所得到的管数，少于所测定的四种水平的稀
10、释液的管数的2/3，用手计算样品浓度的数据是不充分的。如果剩余管数是原来管数的2/3或更多，则可根据平均值计算其样品的含量。注g不可使用金属帽(除了不锈钢盖)，这是由于试管在培养振荡过程中有金属污挠的可能性.7 分析结果的寝述样晶中肌醇的含量(叫m吨町g/川/1峭0啕0饨叫E或如m吨町E町川/几l式中:x-测定管中每毫升测试溶液中肌醇含量的平均值，g，m-一样品的质量或体积，g或mL.8 允许直同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。方法二气相色谱法9 方法提要样品中的肌醇与衍生剂反应后，经气相色谱时行分离定量。10试J10.1 N-=甲基硅基咪略。10.2 三甲基氯硅烧。11
11、仪器11. 1 气相色谱仪:F1D检测器。m IU 325 GB/T 5413.25-1997 11. 2 包谱柱，50%Phenylmethylcloxa肘，Db-17(&.w).O. 32mm idX30m 0.25m. 12 操作步骤12. 1 准确称取Ig样品于烧杯中，用温水溶解，转至100mL容量瓶中，定容。取5.0mL该溶液放入小试管中作为测定液。12.2 准确称取50mg肌醇标样于小烧杯中，用水溶解，转至100mL容量瓶中，定容.用吸量管取该榕液5mL于一100mL容量瓶中，用水定容。取此溶液2mL于小试管中。12.3 将上述分别含有样品和标准溶液的试管冷冻干燥.于每个试管中加l
12、mL内标榜液每毫升毗晓中含0.05mg的惠)，盖紧塞子，放置15min.于每个试管中加0.5mL的N三甲基硅基咪略和0.2mol/L的，混合，静置15min后进样。12.4 气相色谱条件sa)柱温，140-260C(5 C /min) , b)检测器，FID，。检测器温度，280C，d)进样帮，split(l,40) , e)进样器温度，280C，0迸样体积，lL，g)流速，1.4mL/min. 13 分析结果的寝述A./A. 200 X c X 200 样品中饥醇含量(mg/l00g)=一X一一一一一一一A.JAi n m 式中，c一-标准工作液浓度，g/mL，A，一一样品峰面积，A.一一标样峰面积，A.j-一样品内标峰面积，A皿标样内标峰面积，m一一样品的质量，g。14 允许磐同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5%.326 ( 6 )
