1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1686-2005 新城疫病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法Detection of mesogenic and velogenic strains of newcastle disease virus一Method of the real-time RT-PCR 2005-09-30发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2006-05-01实施060509000054 前言本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人:张鹤
2、晓、刘环、高志强、张利峰、谷强、王甲正。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1686-2005 I 1 范围新城瘦病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法本标准规定了新城疫病毒中强毒株TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于禽类及其产品新城疫病毒中强毒株的检测。2 规范性引用文件SN/T 1686-2005 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T
3、 19438. 1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3 缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 1 荧光RT-PCR荧光反转录-聚合酶链反应。3.2 Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的|明值时所经历的循环圈数。3.3 RNA 核糖核酸。3.4 Taq酶Taq DNA聚合酶。3.5 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水。3.6 DEPC 焦碳酸乙二醋。4 原理采用TaqMan方法，在比对新城疫病毒F基因序列的基础上，设计针对F基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示)，3端标记TAMPA荧光素为悴灭荧光基团(用Q表示)，它在近距离
4、内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的53的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 检测实验室的设置与管理中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438. 1-2004 附录C。6 试剂和仪器6. 1 试荆除另有说明，所用试剂均为分析纯;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。1
5、SN/T 1686-2005 6. 1. 1 三氯甲烧。6. 1. 2 异丙醇:-200C预冷。6. 1. 3 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水(符合GB6682要求)配制，-200C预冷。6. 1. 4 0.01 mol/L(pH 7.2)的PBS:配方见附录Ao(121土2)OC，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000IU/mL。6. 1. 5 中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒飞试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B。6.2 仪器设备6.2.1 高速台式玲冻离心机:最大离心力12000 r/min以上。6.2.2 荧光PCR检测仪、计算
6、机。6.2.3 20C 80C冰箱和-200C冰箱。6.2.4 微量移液器:0.5L10L，5L20L.20L200L，200L，._，1 000L。6.2.5 组织匀浆器。6.2.6 tl昆匀器。7 样晶的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。7.1 取样工具7. 1. 1 棉拭子、剪刀、慑子、研钵、Eppendorf管。7.1.2 所有上述取样工具必须经(121士2)OC, 15 min高压灭菌并烘干或经1600C干烤2h。7.2 采样方法7.2. 1 活禽样晶7.2. 1. 1 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深人喉头及上膊裂来回刮3次，._，5次，取
7、咽喉分泌液。7.2. 1. 2 世殖腔拭子采样，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便。7.2. 1. 3 将采样后的咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0 mL PBS的Eppendorf管中，编号备用。7.2.2 内脏或肌肉样晶用无菌的剪刀和慑子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mL PBS混匀，或置于组织匀浆器中，加入10mL PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中3000 r/min离心10min，取上清液转入另-无菌Eppendorf管中，编号备用。7.2.3 血清或血浆用元菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。7.3 存放与运送采集或处理的样
8、本在20C80C条件下保存应不超过24h;若需长期保存，须放置-700C冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后，采用保植壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。8 操作方法8. 1 样本核酸的提取在样本处理区进行。2 1)由指定单位提供，给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。SN/T 1686-2005 8. 1. 1 取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。8. 1.2 每管加入600L裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照
9、和阳性对照各200L，一份样本换用一个吸头;再加入200L三氯甲烧，混匀器上震荡?昆匀5s。于40C条件下，12000 r/min离心15 min 8. 1. 3 取与8.1.1中相同数量的1.5 mL灭菌Eppendorf管，加入500L异丙醇(一200C预冷)，对每个管进行编号。吸取8.1.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500L，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。8. 1. 4 于40C条件下，12000 r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入600L75
10、%乙醇，颠倒洗涤。8. 1.5 于40C条件下，12000 r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。8.1.6 4000 r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不榕。8. 1. 7 加入11LDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000 r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一700C冰箱，将核酸转移至反应
11、混合物配制区。8.2 扩增试剂准备与配制在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出中强毒株NDVRT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000 r/min离心5s。设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用15LRT-PCR反应液及0.25LTaq酶。计算各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入0.25Xn颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15L，转移至样本处理区。8.3 加样在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入7.2.7中制备的RNA榕液10L，使总体积达25L。盖紧管盖后，500r/min离心
12、30s。8.4 荧光RT-PCR反应在检测区进行。将7.4中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置:第一阶段，反转录。OC/30min; 第二阶段，预变性920C/3min; 一一第三阶段，920C/10s , 450C/30 s , 720C/1 min，5个循环;一一第四阶段，920C/10s , 60oC/30 s，40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时进行。9 结果判定9. 1 结果分析条件设定读取检测结果。阔值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。9.2 质控标准9.2. 1 阴性对
13、照无Ct值并且无扩增曲线。9.2.2 阳性对照的Ct值应30.0，并出现特定的扩增曲线。9.2.3 如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。3 SN/T 1686-2005 9.3 结果描述及判定9.3.1 阴性无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无中强毒株新城疫病毒。9.3.2 阳性Ct值30.0，旦出现特定的扩增曲线，表示样本中存在中强毒株新城疫病毒。4 SN/T 1686-2005 附录A(规范性附录)磷酸盐缓冲生理盐水配方所用试剂均为分析纯以上。A.1 A班0.2 mol/L磷酸二氢铀水榕液NaH2P04 H20 27.6 g，榕于蒸馆水中，最后稀释至1000 mL。A.2
14、 B液0.2 mol/L磷酸氢二锅水溶液Na2HP04 7H20 53.6 g，(或Na2HP04 12H20 71. 6g或Na2HP04 2H20 35. 6 g)加蒸馆水溶解，最后稀释至1000 mL。A.3 0.01 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水的配制0.2 mol/L A液14mL 0.2 mol/L B掖36mL 加氯化纳18.5g 用蒸馆水稀释至1000 mL 5 SN/T 1686-2005 附录B(资料性附录)中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR试荆盒组成、说明及使用时的注意事项B.1 试剂盒的组成试剂盒的组成见表B.1，表B.1试剂盒组成组成(48tests/盒)
15、数量裂解液30 mLX 1盒中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR反应液750LX1管RT-PCR酶颗粒(带盖PCR反应管装)1颗/管X12管Taq酶/(5U/L) 12LX1管DEPC水1 mLX1管阴性对照1 mLXl管阳性对照(非感染体外转录RNA)1时，X1管B. 2 说明B. 2.1 裂解液的主要成分为异硫氨酸肌和盼，为RNA提取试剂，外观为红色，于40C保存。B. 2. 2 DEPC水，是用l%DEPC处理后的去离子水，用于洛解RNA。B. 2. 3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。B.3 使用时的注意事项B. 3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得
16、交叉污染。B.3.2 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质世漏污染仪器。B. 3. 3 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，RT-PCR酶在室温条件下必须置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。B.3.4 除裂解液外，其他试剂-200C保存。有效期为6个月。6 mCON-嗖Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准新城症病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法SN/T 1686-2005 晦中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷晤开本880X 1230 1/16 印张0.75字数12千字2006年1月第一版2006年1月第一次印刷印数1-2000* 书号:155066 2-16610 JG 定价8.00SN/T 1686-2005
