1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犳狉狅犿犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 禁止翻制、电子发售书书书前言本标准按照给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡孔新、王汉华、杨鹏飞、平芮巾、孙肖红、杨宇、王静、张乐。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速
2、检测方法范围本标准规定了国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法，包括样本抗原和核酸快速检验鉴定方法及检测结果的分析与判读。本标准适用于对国境口岸蚊类携带的日本脑炎病毒的检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求国境口岸生物因子恐怖事件监测规程国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法流行性乙型脑炎诊断标准及处理原则微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部，年月日）术语与定义下列术语
3、和定义适用于本文件。日本脑炎犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊由日本脑炎病毒引起、由蚊传播的中枢神经系统急性传染病，也称流行性乙型脑炎。临床上以突然起病，高热、头痛、呕吐、嗜睡或昏迷、惊厥为特征。检测对象入出境交通工具、运输设备、货物、行李、邮包等藏匿和捕获的及口岸区域捕获的蚊虫。实验室生物安全要求实验室生物安全要求按照、和执行。样本采集、处理与转运样本采集、处理与转运参见、中第章和附录以及可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定执行。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售胶体金免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原主要仪器生物安全柜。可调式微量加样器及塑料尖吸头。液氮运输罐、液氮
4、储存罐。普通冰箱、超低温冰箱（）。玻璃研磨器、研磨棒。主要试剂及其制备狀犿胶体金的制备取双蒸水，加热至沸腾。加入新鲜制备的的氯金酸溶液加速搅拌，同时加入新配置的的柠檬酸钠溶液，加热直到溶液变成酒红色后冷却，避光保存。免疫层析试纸制备兔抗日本脑炎病毒蛋白多克隆抗体标记结束的胶体金溶液以为的溶液（含，蔗糖）重悬，浸湿结合垫后干燥。以浓度为的日本脑炎全病毒鼠免疫多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检测带。以浓度为的羊抗兔在硝酸纤维素膜上划线作为质控线，参数划线，检测线与质控线间距离约为。将吸收垫、样品垫及处理后的结合垫、硝酸纤维素膜叠加，组装成完整的层析条，然后切割层析条，宽度每条，干燥避光保存待用。
5、狆犎为的犿狅犾犔犜狉犻狊溶液的溶液与的盐酸混匀后，加双蒸水稀释至，混匀后将上述溶液与双蒸水按稀释即为的的溶液。狆犎为的犿犿狅犾犔犘犅溶液称取磷酸二氢钠加双蒸水至溶解即为的磷酸二氢钠溶液；称取磷酸氢二钠（）加双蒸水至溶解即为磷酸氢二钠溶液。取的磷酸二氢钠溶液，取磷酸氢二钠溶液混匀后加双蒸水按稀释即可。样本处理液为含的溶液。检测步骤将免疫胶体金试剂盒内的检测卡、样本处理液等置于室温下平衡。液氮研磨蚊媒组织成粉末状后加适量（只批次可加入）的为的液重悬，混匀后于，犵离心，取上清液，即为蚊媒悬液。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售取蚊媒组织悬液，用滴管或加样器滴加样本处理液，混匀后从试管中取滴滴或样品滴
6、加于样品孔内。结果应在内观察，阳性结果最早即可显示出来，但阴性结果应在后才可判定。结果判断当层析观测窗“”（对照）处未出现条状红色沉淀线，则无论层析观测窗“”（检测）处是否有显示均为无效，应重新检测。当层析观测窗只有“”（对照）处出现条红色沉淀线，而“”（检测）处无红色沉淀线，报告为检测结果阴性，即没有检出日本脑炎病毒抗原。当层析观测窗“”（对照）处和“”（检测）处出现条红色沉淀线，报告为检测结果阳性，即检出日本脑炎病毒抗原。结果示意见图。犪）阳性犫）阴性犮）无效犱）无效图免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原的结果示意图日本脑炎病毒核酸反转录聚合酶链反应（犚犜犘犆犚）检测主要仪器扩增仪。低温高速台式
7、离心机。电泳仪及电泳槽等。凝胶成像分析系统仪或紫外投射仪。微型混合器、涡旋振荡器。可调式微量加样器及塑料尖吸头。恒温水浴箱。生物安全柜。超净工作台。高压灭菌锅。主要试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售核酸提取试剂：用美国公司提取病毒核酸）。反转录试剂：用美国公司的反转录试剂盒）。扩增试剂：用美国公司的核酸扩增试剂盒?）。）、）、）为美国公司提供产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。（）或类似范围的商品化。检测的引物见表。表日本脑炎病毒检测的犘犆犚引物引物序列（）位置
8、片段随机六聚休检测步骤核酸提取吸取样本处理液加入溶解的裂解液。脉冲混匀，置于室温。短暂离心，加入无水乙醇（）脉冲混匀。短暂离心。将旋转柱置于收集管中。从步骤中吸取溶液转移至旋转柱上，犵离心，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，重复步骤。打开旋转柱盖，加入洗液，盖紧盖子，犵离心。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，加入洗液，盖紧盖子，犵离心。将旋转柱放至干净的收集管上，犵再离心。将旋转柱放至干净的离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。打开旋转柱盖，加入室温平衡的缓冲液。盖紧盖子，室温放置。犵离心。收集滤出液，用于扩增。储存。犚犜犘犆犚检测反
9、转录：取上述总放入管中，加入随机六聚体引物（），变性后迅速放入冰浴中退火杂交，然后依次加入、的逆转录酶缓冲液、（）、逆转录酶，无酶的水补足。将以上混合体系混合，作用，灭活。扩增反应体系：取上述合成的为模板，依次加入、上游和下游犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售引物（见表）各、犜犪狇聚合酶，以无酶的水补足的反应体系，稍加离心后，放入扩增仪。扩增反应条件：预变性然后进入循环；，共个循环，最后，延伸。凝胶电泳扩增产物，经的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统照相记录结果。结果判定质量控制反应结果同时符合以下两个条件，否则实验结果无效：阴性对照未出现特异性条带；阳性对照出现预期大小的扩增条带。结果分析在
10、实验结果有效情况下，如待测样本出现预期大小的扩增条带，则可初步判断待测样本为日本脑炎病毒基因阳性；如待检样本扩增产物在处没有出现条带，则可初步判断待测样本为日本脑炎病毒基因阴性。测序（可选择）切下目的条带，用凝胶回收试剂盒回收（按其说明书进行），自动测序仪测序，确认病毒基因，也可进一步分析病毒基因的变异情况。阳性结果的处理对阳性结果的相应标本应送相关的实验室进行进一步复检和鉴定。阳性结果应按规定向上级主管部门报告。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子发售
