1、ICS 67040X 00中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一52008动物性食品中阿维菌素类药物残留检测酶联免疫吸附法，高效液相色谱法和液相色谱一串联质谱法Determination of avermectins residue in animal derived foodELISA methodHPLC method and LCMSMS method20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部1 025号公告一52008本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出和归口。本标准起草单位：四川省兽药监察所、中国农业大学动物医
2、学院。本标准主要起草人：沈建忠、杨松沛、彭莉、张素霞、岳秀英、史为民、熊浩山、官艳丽。本标准系首次发布的国家标准。1范围农业部1 025号公告一52008动物性食品中阿维菌素类药物残留检测酶联免疫吸附法，高效液相色谱法和液相色谱一串联质谱法第一法酶联免疫吸附法(ELISA)本部分规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量的制样和酶联免疫吸附测定法。本部分适用于牛肝脏和牛肌肉中埃普利诺菌素、阿维菌素和伊维菌素残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注El期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成
3、协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样31样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。32样品的保存一20冰箱中贮存备用。4测定方法41方法原理或提要采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的阿维菌素类药物与酶标板上的偶联抗原竞争阿维菌素抗体，加入酶标记的羊抗兔抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450 m处测定吸光度，吸光值与阿维菌素类药物残留量成负相关，与标准曲线比较即可得出阿维菌素类药物残留含量。42试剂和材料以下所用的试
4、剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1乙腈422正己烷4 2 3无水硫酸钠424阿维菌素类药物试剂盒4 2 4 1包被有阿维菌素偶联抗原的96孔板规格为12条8孔。4242阿维菌素标准溶液至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白。1农业部1025号公告一520084 24 3阿维菌素抗体溶液4244过氧化物酶标记物4 2 4 5底物显色溶液A液4 2 4 6底物显色溶液B液4247反应终止液4 2 4 8 2倍浓缩缓冲液4 2 4 9 20倍浓缩洗涤液425碱性氧化铝柱2 g4 26缓冲液工作液用水将2倍浓缩缓冲液按1：1体积比进行稀释(1份2倍浓缩
5、缓冲液+1份水)，用于溶解对样品进行前处理后获得的干燥残留物。4保存，有效期1个月。427洗涤液工作液用水将20倍浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于洗涤酶标板。4保存，有效期1个月。4 3仪器和设备431酶标仪配备450 D_m滤光片。432天平感量oOl g。433超声波清洗器434离心机4 3 5氮气吹干仪4 3 6匀浆机437振荡器4 3 8涡漩式混合器4 3 9微量移液器单道 20肛L、50 pL、100 pL。多道移液器50 pL300 pL可调。4 4试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料
6、。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定步骤4 5 1样品前处理称取试样(3o01)g于50mL离心管中，加乙腈9m1、正己烷3mL，振荡10rain，加无水硫酸钠3 g，再振荡10 min,于15T 3 000 rrain离心lOmin，除去上层正己烷，取下层提取液40 mL备用。取碱性氧化铝柱，加无水硫酸钠3 g，加乙腈10 mL预洗，加备用的提取液40 mL，收集流出液于10 mL玻璃试管中，再加乙腈4 mL，收集于同一试管中，5060水浴下氮气吹干。用缓冲液工作液10 mL溶解干燥的残留物，涡动1 rain，超声10 rain，涡动1 rain。分取溶解
7、液100止，加缓冲液工作液100止，充分混合，取20止分析。2农业部1025号公告一520084 52测定使用前将试剂盒于室温(1925C)下放置1 h2 h。4521按每个标准溶液和试样溶液至少做两个或两个以上平行实验，计算所需酶标板条的数量，插入板架。45 2 2加20“L系列标准溶液或试样溶液到各自的微孔中。标准和试样至少两个平行。4523往各孔中加抗体工作液80止，充分混合，37恒温箱中孵育30 min。4 5 2 4倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。加洗涤液工作液250“L于各L中，倒出，拍打。洗涤步骤重复操作三遍以上(或用洗板机洗涤)。4 5 2 5
8、加过氧化物酶标记物100 pL，37恒温箱中孵育30 min。45 2 6倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250 pL洗涤液工作液充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。4527加底物显色液A液和B液各50止，混匀，37恒温箱避光显色15 min30 min。45 2 8加反应终止液50“L，轻轻振荡混匀，用酶标仪在450 nm波长处测量吸光度值。46结果计算和表述用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式(1)：相对吸光度值()一晏100式中：B为标准(试样)溶液的吸光度值；Bo空白(浓度为0标准溶液)的吸光度值。
9、将计算的相对吸光度值()对应阿维菌素标准品浓度(figL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。5交叉反应阿维菌素 100跖埃普利诺菌素 130伊维菌素 33蹦多拉菌素 5泰乐菌素 o1替米考星 O16检测方法灵敏度、准确度、精密度61灵敏度本方法在牛肝和牛肉中的检测限均为2”gkg。6 2准确度本方法在5“gkg20”gkg添加浓度水平上的回收率为60120。63精密度本方法的批内变异系数30，批间变异系数45。农业部1 025号公告一52008第二法高效液相色谱法(IIPLC)7范围本部分规定了动物源食品中阿维菌素类
10、药物残留量的高效液相色谱法。本部分适用于牛肝脏、牛肌肉和猪肝脏中埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的检测。8规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法9制样91样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。9 2样品的保存一20。C以下冰箱中贮存备用。10测定方法10 1方法原理或提要用乙腈提
11、取试样中的阿维菌素类药物，经碱性氧化铝柱和C。s固相萃取柱净化，荧光衍生化后，用高效液相色谱法，荧光检测器检测，外标法定量。102试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的二级水。10 2 1甲醇色谱纯。1022乙腈色谱纯。10 23无水硫酸钠。10 2 4乙酸酐色谱纯。10 2 5 1_N甲基咪唑。102 6 Cls固相萃取柱200 mg3 mL。10 2 7碱性氧化铝固相萃取柱2 g。10 2 8埃普利诺菌素对照品(Eprinomectin)纯度98。10 2 9阿维菌素对照品(Avermectin)纯度98。10 210多拉菌素对照品(Doramectin)纯
12、度943X。10 2 11伊维菌素对照品(Ivermectin)纯度98。10 2 12衍生化试剂a)A液：1甲基咪唑+乙腈一2+5，vv。b)B液：乙酸酐+乙腈一3+4，vv。4农业部1025号公告5200810 2 13阿维菌素类药物标准储备液(100斗mL)分别准确称取埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素对照品约10mg于100mL容量瓶，用乙腈溶解稀释至刻度。一20下保存，有效期6个月。10 214阿维菌素类药物标准储备液(1腭mL)取100“gmL阿维菌素类药物标准储备液10mL于100m1容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，4。CT保存，有效期6个月。10 2 15标准工作液分别量取
13、适量1“gmL阿维菌素类药物标准储备液，用乙腈稀释成浓度为1、5、10、20、50、100和200 rigmL的系列标准工作液。10 3仪器10 3 1高效液相色谱仪配荧光检测器。10 3 2组织匀浆机103 3涡动仪103 4离心机10 3 5旋转蒸发仪10 3 6天平感量001 g。10 3 7分析天平感量0000 Ol g。1038氮吹仪103 9控温箱104试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。10 5测定步骤10 5 1提取称取试样25 g(精确到0Ol g)于50mL
14、离心管中，加8mL乙腈，涡动05rain，2 000 rrain离心2 rain，取上清液。残渣用8 mL乙腈重复提取一次，合并两次上清液。10 5 2净化取碱性氧化铝柱，加2 g无水硫酸钠。加10 mL乙腈预洗，将上清液过柱，收集滤液于鸡心瓶中。接着用5 mL乙腈洗脱，收集于同一鸡心瓶中，50下减压浓缩至干。用05 mL乙腈溶解残余物，涡动05 min，使充分溶解，备用。取C。固相萃取柱，用5mL乙腈预洗，将备用液过柱，收集流出液于5mL刻度试管内，继续用3mL乙腈洗脱，收集于同一试管中，50。C下氮气吹干，备用。10 53荧光衍生化加i00“L衍生化试剂A液，涡动05 min，再加100
15、pL衍生化试剂B液，涡动05 min，密闭，于96。C衍生化反应100min，加50“L乙腈，过045 pm滤膜，进HPLC分析。10 5 4测定105 4 1色谱条件色谱柱：c。8，250 mmX46lnl，粒径3 pm，或相当者。流动相：甲醇一水(97+3，vv)。5农业部1 025号公告一52008流速：1 mI，rain。柱温：30。激发波长：365 nm。发射波长：475 nm。进样量：20“L。10 5 4 2液相色谱测定分别取适量衍生化后的试样液和标准工作液进液相色谱测定，做单点校准或多点校准，以色谱峰的峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中阿维菌素类药物的响应值均应在仪器检测的
16、线性范围之内。试样液测定过程中应参插标准工作液，以便准确定量。标准品液相色谱图见附录B中图1。10 6结果计算和表述动物组织中阿维菌素类药物及其代谢物的含量x，以质量分数毫克每千克(pgkg)表示，按式(1)计算：X：CV式中：C试样液中对应的阿维菌素类药物及其代谢物的浓度，单位为微克每毫升(t-gmL)v试样液总体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。11检测方法灵敏度、准确度、精密度111灵敏度本方法在牛肝脏、牛肌肉和猪肝脏中埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为15 Mgkg，定量限均为5 pgkg。1
17、12准确度本方法在5 pgkg100 pgkg添加浓度水平上的回收率为60120。113精密度本方法的批内变异系数20，批间变异系数30。附录A(资料性附录)色谱图农业部1025号公告一52008(EP：埃普利诺菌素；ABM：阿维菌素；DOR：多拉茵素；IVM：伊维菌素)图A 1 5 pg,L阿维菌素类药物标准溶液色谱图(EP：埃普利诺菌素；ABM：阿维菌素；DOR：多拉菌素；IVM：伊维菌素)图A 2牛肝组织5嵋,kg空白添加样品色谱图7(目百ll高【E百ol，高农业部1025号公告一5200812范围(EP：埃普利诺菌素；ABM：阿维菌素；DOR：多拉菌素；IVlvI：伊维菌素)图A 3空
18、白牛肝样品色谱图第三法液相色谱一串联质谱法(LCMSMS)本部分规定了动物源食品中阿维菌素类药物残留量的液相色谱一串联质谱确证检测方法。本部分适用于牛肝脏和牛肌肉中埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的测定。13规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法14制样14，1样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试组织，剪碎，置于组
19、织匀浆机中高速匀浆。142样品的保存20以下冰箱中贮存备用。15测定方法15 1方法原理或提要用乙腈提取试样中的阿维菌素类药物，经c。固相萃取柱和Cs固相萃取柱净化后，用液相色谱串联质谱法测定，色谱保留时间和质谱离子定性，外标法定量。15 2试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682 1992规定的一级水。1521乙腈色谱纯15 2 2三乙胺8农业部1025号公告一520081523甲酸色谱纯15 2 4埃普利诺菌素对照品(Eprinomectin)纯度981525阿维菌素对照品(Avermectin)纯度9815 2 6多拉菌素对照品(Doramectin) 纯度94
20、315 2 7伊维菌素对照品(Ivermectin)纯度981528 c18固相萃取柱500mg3mL15 2 9 C8固相萃取柱500mg10mL15210样品稀释液水一三乙胺(30十0 045，vv)15 2 11 c。8固相萃取柱洗涤液乙腈一水一三乙胺(40+60+0 1，vvv)15 2 12 c8固相萃取柱洗涤液乙腈一水一三乙胺(30+70+01，VV)15 2 13阿维菌素类药物标准储备液(100 IlmL)分别称取埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素对照品约10mg于100mL容量瓶，用乙腈溶解稀释至刻度。一20下保存，有效期6个月。15 214混合标准储备液(1 pgri
21、d)取四种标准储备液各10mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，4下保存，有效期3个月。15 2 15标准工作液分别量取适量上述混合标准储备液，用乙腈稀释成浓度为1、S、10、20、50、100和200 ngmL的系列标准工作液。16仪器16 1 液相色谱串联四级杆质谱仪配有电喷雾电离源(Electray spray ionozition，ESI)。16 2天平感量0 01 g16 3分析天平感量0 000 1 g16 4离心机16 5振荡器16 6涡动仪167氮吹仪16 8组织匀浆机17试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备
22、后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。18分析步骤18 1提取称取试样(25o02)g于50mL离心管中，加8mL乙腈，涡动05rain，2 000 rrain离心2min取上清液。残渣用8 mL乙腈重复提取一次，合并两次上清液。加30 mL样品稀释液，涡动混合均匀为样品提取液。9农业部1 025号公告一5200818 2净化取C，。固相萃取柱，依次用5 mL乙腈、5 mL C，。固相萃取柱洗涤液预洗。将样品提取液过柱。用c-s固相萃取柱洗涤液20mL淋洗，抽干；再用3mL正己烷淋洗，抽干。2mL乙腈洗脱，收集。加4mL样品稀释液，混合均匀，备用。取C8固相萃取柱，依次用5 m
23、L乙腈和C。固相萃取柱洗涤液预洗，取备用液过柱。用10 mLCs固相萃取柱洗涤液淋洗，待流干后抽真空1 mi“；再用8 mL正己烷淋洗，待流干后抽真空1 rain；用2 mL乙腈洗脱，收集洗脱液。于50。C下氮气吹干，加05 mL乙腈溶解。过022m滤膜，进样分析。注：上样溶液、淋洗液和洗脱液的流速均控制在不超过1 mLrain。1 8 3基质添加标准工作液的制备取空白试样按提取与净化进行处理，在洗脱液中加入05 mL相应浓度的标准工作液，于50。C下氮气吹干，加05 mL乙腈溶解。作为基质添加标准工作液，供液相色谱串联质谱仪测定。184测定18 4 1液相色谱条件色谱柱：C18150 mmX
24、21 mm，粒径3“m，或相当者。流动相：乙腈+水+甲酸(95+5+01，Vvv)。流速：02 mLmin。柱温：室温。进样量：10“L。1842质谱条件离子化方式：电喷雾离子源，正离子扫描。毛细管电压：32 kV。离子源温度：120。雾化气：300。倍增器电压：650 V。碰撞气：氩气。其他参数见表1。表1质谱参数设置药物 母离子mzEM+Na+ 子离子(mz) 驻留时间(secs) 碰撞能量(eV) 锥孔电压(Volts)埃普利诺菌素 9366 3520+ 04 28 754900阿维菌素 8956 3274 O4 25 704493多拉菌素 9215 3532。 O4 28 804490
25、伊维菌素 897 5 329 1+ 04 25 707533注：*定量离子1843液相色谱一串联质谱测定根据样品溶液中药物的残留量，选择峰面积相近的标准工作液作为随行标样。对标准工作液和样品溶液等体积参插进样进行测定。四种药物的离子色谱图见图B1至图B3。18 4 3 1定性测定通过液相色谱保留时间与串联质谱选择离子共同定性。待测样品的保留时间与标准样品保留时间的相对偏差不大于25。且与标准品相比，样品中待测组分两个定性子离子的相对丰度比不大于0农业部1 025号公告一5200820。1843 2定量测定分别取适量试样溶液和相应浓度的基质添加标准工作液，作单点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准
26、工作液及试样液中阿维菌素类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样液进样测定过程中应参插标准工作液，以便准确定量。19结果计算与表达动物组织中阿维菌素类药物及其代谢物的含量x，以质量分数毫克每千克(t-gkg)表示，按式(1)计算：X：CXV(1) m式中：C试样液中对应的阿维菌素类药物及其代谢物的浓度，单位为微克每毫升(“gmL)；v_溶解残留物所用流动相的体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位有效数字。20检测方法灵敏度、准确度、精密度201灵敏度本方法在猪肌肉、猪肝脏中埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均
27、为02 pgkg，定量限均为05 pgkg。202准确度本方法在5 pgkg50 pgkg添加浓度水平上的回收率为60120。20 3精密度本方法的批内变异系数20，批间变异系数30。农业部1 025号公告一52008附录B(资料性附录)标准溶液选择离子色谱图ooo 1oo 200 3 oo 4 oo 500 600 7 00 800 9 00 1000(mz 9366为埃普利诺菌素；mz 8956为阿维菌素；mz 9215为多拉菌素；mz 8975为伊维菌素)图B 1 50 pgL阿维菌素类标准溶液的选择离子色谱图农业部1025号公告一52008oCo 1Co 2Co 3(30 400 5 co 6co 7 oo 8co 900 10 oo(mz 9366为埃普利诺菌素；mz 895 6为阿维菌素；mz 921 5为多拉菌素；mz 8975为伊维菌素)图B 2牛组织中10 Igkg空白添加样品选择离子色谱图13农业部1 025号公告一52008146为埃普利诺菌素；inz 8956为阿维菌素；mz 921 5为多拉菌素,mz 897 5为伊维菌素)图B 3空白牛组织样品选择离子色谱图
