1、ICS 65120B 46中华人民共和国国家标准农业部1068号公告一22008饲料中5种糖皮质激素的测定高效液相色谱法Determination of 5 kinds of glucocorticoids in feedsHigh-performance liquid chromatography20080725发布 20080725实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部1 068号公告一22008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心(
2、北京)、河南省饲料产品监督检验站、农业部饲料质量监督检验中心(济南)。本标准主要起草人：李兰、索德成、班付国、谭旭信、杜红鸽、贾振民、吴宁鹏、刘素梅、任爱丽、李俊玲。1范围农业部1 068号公告一22008饲料中5种糖皮质激素的测定高效液相色谱法本标准规定了用高效液相色谱仪测定配合饲料中的5种糖皮质激素。本标准适用于配合饲料中泼尼松、醋酸可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、氟氢可的松的测定。方法最低检出限：泼尼松龙、甲基泼尼松龙为05 mgkg；醋酸可的松、倍氯米松、氟氢可的松为10ragkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修
3、改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样6BT 20195动物饲料试样的制备3原理试样中糖皮质激素经甲醇振荡提取，再经活性炭吸附柱、氨基柱串联净化后注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外检测器测定。4试剂和溶液除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GBT 6682规定的一级用水。4 1乙腈：色谱纯。4 2甲醇：色谱纯。43甲醇：分析纯。4 4二氯甲烷：分析纯。4 5流动相：溶
4、剂A一水；溶剂B乙腈。46淋洗液：15甲醇水。47洗脱液：二氯甲烷甲醇(7+3)。4 8糖皮质激素标准品：泼尼松龙、醋酸可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、氟氢可的松的纯度均应大于95。4 9糖皮质激素标准溶液4 9 1糖皮质激素标准贮备液：分别准确称取已知纯度的泼尼松龙、醋酸可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、氟氢可的松标准品各50mg，精确至00001 g，分别置于50mL棕色容量瓶中，加甲醇(42)超声使之完全溶解，并定容至刻度，摇匀，该溶液中泼尼松龙、醋酸可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、氟氢可的松浓度均为1 mgmL，于一20保存可使用3个月。4 9 2糖皮质激素标准混合中间液：分别准确移取泼
5、尼松龙、醋酸可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、氟1农业部106B号公告一22008氢可的松标准贮备液(491)各5 mL，置于50 mI。棕色容量瓶中，甲醇(42)定容至刻度。该溶液中泼尼松龙、醋酸可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、氟氢可的松浓度均为100#gmL，=y-200C保存可使用1个月。4 9 3糖皮质激素标准混合工作液：准确移取糖皮质激素标准中间液(492)10mL、25mL、50mL、100mL于50mL棕色容量瓶中，用甲醇(42)定容至刻度，此时溶液中各种糖皮质激素的浓度分别为1 tugmL、5 pgmL、10-gmL、20,ugmL。于200cfige，可使用2周。5仪器和设备5
6、1实验室常用仪器和设备。5 2电子天平：感量o0001 g和0001 g。5 3涡轮混合器。54振荡器。5 5离心机：12 000 rmin15 000 rmin(离心力为17 313 g26 895 g)。56旋转蒸发器。57 SPE活性炭吸附柱：500 mg6 mL。58 SPE氨基柱：500 mg6 mL。5 9氮吹仪。5 10针头过滤器：备孔径为045“m有机微孔滤膜。5”高效液相色谱仪：配紫外检测器。6试样的制备按GBT 146991采样。按OBT 20195制备样品。7分析步骤7 1试液的制备7，1 1提取称取配合饲料5 g(精确至0001 g)，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加
7、入15mL的甲醇(43)，于涡轮混合器(53)涡旋混合30s，于振荡器(54)振荡提取20 min。于离。O屯|l(65)上以17 212 g的离心力离心，上清液转移至50 mL旋转蒸发瓶中。重复上述步骤提取、离心、转移一次，合并两次上清液备用。71 2浓缩于旋转蒸发器(56)上40。C50。C将(711)中的液体全部蒸干(避免爆沸)。加入4 mL甲醇(43)，于超声波超声30 s溶解残渣，再加入16mL水，混合超声30 s，充分混合，转移至另一支50mL聚四氟乙烯离心管中，以26 895 g的离心力离心5 min，上清液备用。71 3净化用6 mL二氯甲烷(44)、6 mL甲醇(43)、6
8、mL水活化活性炭吸附柱(57)。准确加入(712)中的试液10 mL，加入3 mL淋洗液(46)淋洗小柱，抽干小柱约30 rain。用6 mL二氯甲烷甲醇(7+3)活化氨基柱(58)，将氨基柱串联在活性炭吸附柱下方。加入6 mL洗脱液(47)洗脱串接小柱并收集洗脱液，氮吹仪(59)50 oc氮气：p，加入o5 mL甲醇(43)溶解，过滤膜(510)上液相色谱仪(511)测定。注：对高含量的样品，应调整过柱体积，保证活性炭吸附柱上组分的量小于35 pg。72测定?农业部1068号公告一220087 2 1液相色谱条件色谱柱：具有C-s填料的柱子(粒度为5“m)，柱长250 mm，内径46 mm。
9、流动相：以10 mI。min流速梯度洗脱。梯度条件见表1。进样量：20“I。柱温：30。检测器：紫外检测器，检测波长254 nm。表1洗脱梯度表时间，mln 溶剂A， 溶剂B，800 70 301600 50 502200 70 3025 00 10 9028 OO 70 307 2 2定量测定7 2 2 1按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。向液相色谱柱中注入糖皮质激素标准混合工作液(493)及试液(7L 3)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。7 2 2 2结果计算试样中每种糖皮质激素的含量w。，以毫克每千克(mgkg)表示，按式(1)计算： 毗一等黼毗一i又i而L1式中：P：试样溶
10、液峰面积值；V样品的总稀释体积，单位为毫升(mL)；o标准溶液浓度，单位为微克每毫升(“gmL)；U，标准溶液进样体积，单位为微升(“L)；P。标准溶液峰面积平均值；m试样质量，单位为克(g)；V：试样溶液进样体积，单位为微升(“L)。7 2 3平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。8重复性同一分析者对同一试样同时2次平行测定结果的相对偏差不大于lo。农业部1 068号公告一220084附录A(资料性附录)5种糖皮质激素出峰顺序VWDl A，Wavelength=254 nm(20080619TPZJS001 D11泼尼松龙；2 醋酸可的松；3甲基泼尼松龙4倍氯米松；5 氟氢可的松。农业部1 068号公告一22008f扒 、m1 泼尼松龙；2醋酸可的松；3 甲基泼尼松龙4倍氯米松；j氟氢可的松。a 氢化可的松b倍他米松；c 地塞米松。5
