1、ICS 67050X 04 a寓中华人民共和国国家标准GBT 22957-2008河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of nine glucocorticoids residues in fugu，eel and baked eelLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-01实施丰瞀髅鬻瓣警糌学篓发布中国国家标准化管理委员会促111刖 昌本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘永明、李金、吴艳萍
2、、冯冠、曹彦忠、庞国芳。GBT 22957-20081范围河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22957-2008本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松九种糖皮质激素残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定。本标准的方法检出限：泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松为02 pgkg；倍氯米松、醋酸氟氢可的松为1o pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准
3、的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 668
4、2 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理河豚鱼、鳗鱼、烤鳗样品中加入无水硫酸钠，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后，经过硅胶固相萃取柱净化，液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44乙酸乙酯：色谱纯。45甲酸：优级纯。46正己烷：色谱纯。47丙酮：色谱纯。48丙酮一正已烷溶液：丙酮+正己烷(2+3)。量取200 mL丙酮与300 mL正己烷混匀。49无水硫酸钠：分析纯。在650马弗炉中灼烧6 h，储存于干燥器中。410泼尼松龙(CAS：50248)、泼尼松(CAS：53032)、氢化可的松(CAS：502
5、37)、可的松(CAS：53一065)、甲基泼尼松龙(CAS：83432)、倍他米松(CAS：378449)、地塞米松(CAS：50022)、倍氯米松(CAS：441939一o)、醋酸氟氢可的松(CAS：514363)标准物质：纯度98。411 10 mgmL标准储备溶液：分别准确称取适量的糖皮质激素标准物质，用甲醇溶解，分别配制成1GBT 22957-200810 mgmL储备溶液。配成的标准储备液应在温度低于一20冰箱中保存。412 50 pgmL标准工作溶液：分别准确吸取适量的糖皮质激素标准储备溶液，用甲醇分别配制成50 ttgmL标准工作溶液。配成的标准工作溶液应在温度低于4冰箱中保存
6、。413混合标准工作溶液I：分别吸取适量的氢化可的松和可的松标准工作溶液，用甲醇配成浓度为005 pgmL的混合标准工作溶液。此溶液应在温度低于4冰箱中保存。测定样品使用时，用zo乙腈溶液将混合标准工作溶液I配成不同浓度的的混合标准工作溶液。414混合标准工作溶液：分别吸取适量的泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松标准工作溶液，用甲醇配成泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松为005 pgmL，倍氯米松、醋酸氟氢可的松为025 ggmL的混合标准工作溶液。此溶液应在温度低于4冰箱中保存。4t5基质混合标准工作溶液：用空白样品提取液将混合标准工
7、作溶液配残不同浓度的基质混合标准工作溶液。此溶液应现用现配。416 Cleanert Silica固相萃取柱1或相当者：500 mg，6 mL。使用前用6 mL正己烷预处理，保持柱体湿润。417滤膜：02 p-m。5仪器51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52分析天平：感量01 mg和001 g。53固相萃取真空装置。54真空泵：真空度应达到80 kPa。55均质器。56振荡器。57高速冷冻离心机：转速13 000 rmin。58旋转蒸发器。59氮气浓缩仪。510具塞塑料离心管：50 mL。511样品管：10mL。512梨形瓶：150 mL。6试样的制备与保存61试样的制备从
8、全部样品中取出有代表性样品约1 kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，注明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样保存将试样于一18冷冻保存。7测定步骤71提取称取5 g试样(精确到001 g)，置于50mL具塞塑料离心管中，加入lO g无水硫酸钠，加25mL乙1)Cleanert Silica固相萃取柱是Agela公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GBT 22957-2008酸乙酯，用均质器均质1 rain，在振荡器中
9、振荡20 rain，以10 000 rmin离心10 rain，取上清液至梨形瓶中。再用25 mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液，用旋转蒸发器于45水浴上减压蒸发至近干，用l mL乙酸乙酯和5 mL正己烷溶解。72净化将提取液移至经预处理的Cleanert Silica固相萃取柱中，用6 mL正己烷洗涤梨形瓶和萃取柱，弃去全部流出液。减压抽干1min，用6mL丙酮+正己烷(2十3)洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中，用氮气浓缩仪吹干，用1 mL 20乙腈溶液溶解残渣，以4 000 rrain离心5 min，上清液过02 pm滤膜，供液相色谱一串联质谱仪测定。73测定条件731液相色谱参考条件a)
10、 色谱柱：Atlantis c183“m，150 mm21 mm(内径)或相当者；b)柱温：30；c)进样量：20“L；d) 流动相、流速和梯度洗脱条件见表1。表1 流动相、流速和梯度洗脱条件时间min 流速(pLmin) 乙腈 01甲酸溶液000 200 20 8010 00 200 70 301300 200 90 101301 200 20 802000 200 20 80732质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；b)扫描方式：负离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)气帘气压力：0138 MPa；e)雾化气压力：0276 MPa；f)辅助加热气压力：0138 MPag)离子
11、源温度：500；h)定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表2。表2糖皮质激素的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量化合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(m) 去簇电压v 碰撞能量V405529 30 一25泼尼松龙 口rednisolone 405329405359 30 一15403327 19 21泼尼松 403327403357 一19 15407331 28 25氢化可的松 hvdrocortisone 407331407361 28 15405329 22 24可的松 405329405359 22 15GBT 22957-2008表2(续)化
12、合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 去簇电压V 碰撞能量V419343 32 23甲基泼尼松龙 methylprednisol。ne 419343419373 32 一16437361 一Z5 24倍他米松 betamethasone 437361437391 25 15437361 25 24地塞米松dexamethasone 437361437391 25 15453377 22 一20倍氯米松 heclomethasoae 453377453407 一ZZ 一17fludrocortisone 467421 28 17醋酸氟氢可的松 467421acet
13、ate 467349 28 3274液相色谱一串联质谱测定741定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合标准工作溶液的保留时间偏差在士25之内；且样品谱图中各组分监测离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液谱图中对应的监测离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 KlO允许最大偏差 士20 土25 30 50742定量滔定外标法定量。在仪器最佳工作条件下，对混合标准工作溶液I和基质混合标准工作溶液分
14、别进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，九种糖皮质激素的参考保留时间见表4，九种糖皮质激素的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加回收率数据参见附录B中的表B1。表4九种糖皮质激素的参考保留时间化合物名称 保留时间rain 化合物名称 保留时间rain泼尼松龙 1163 倍他米松 1300泼尼松 1172 地塞米松 1310氢化可的松 1179 倍氯米松 1343可的松 ll 96醋酸氟氢可的松 1458甲基泼尼橙龙 127l75平行试验按以上步骤，对同一试
15、样进行平行试验测定。76空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。48结果计算九种糖皮质激素残留量的测定结果按式(1)计算：x=c筹黑 式中：x 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)v样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m 样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度GBT 22957-200891一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的
16、绝对差值不超过重复性限r，糖皮质激素添加浓度范围及重复性方程见表5。表5添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R泼尼松龙 o250 lgr=0 859 4lgm一0778 2 R一0170 3m+O031 9浚尼松 0250 剐0 210 0m一0000 6 IgR=1079 8 lgm一0619 6氢化可的松 0250 Igr=1096 2 IgmO722 6 lgR一1 114 2 Igm一0661 4可的松 0250 lgr一0955 2lgm一0758 4 R一0236 60 004 1甲基泼尼松龙 0250 lgr=1062
17、1 lgm一0718 7 lgR一0964 3 lgm一0642 3倍他米松 0250 lgr=1068 6 lg m一0689 9 lgR一1158 5 lgm一0616 8地塞米松 0250 lgr=1121 719m一0690 0 lgR=1188 2 lgm0622 9倍氯米松 1 025 lgr=0999 3 lgm一0722 2 lgR=0861 3 lgm一0478 3醋酸氟氢可的松 1025 剐0 109 2m+0 127 9 IgR一0929 2 lgmO591 5注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在
18、再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，糖皮质激素添加浓度范围及再现性方程见表5。GBT 22957-20086附录A(资料性附录)九种糖皮质激素的多反应监测(MRM)色谱图九种糖皮质激素的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。响塞。l1响藿z1响啬t321I可的橙图A1 九种糖皮质激素的多反应监测(MRM)色谱图fmin一埔百如万一而一订橙一雠了倍i一咖撕伽啪啪。响应值。脚驰丽ilIIIIJ一2一，橙。舸订雠T醋百浏叫叫叫鼍。响应值帆f_7lJlI南一1龙1毗：鸭，。，。，Lo蚰l_；l上讯r松T髓r，叫，叫，翌一蝴篙。响应值临叩il由橙r的一可一4化一一一0OO0
19、00篇曼g。响应值雨04一r【=蓍|寸I一附录B(资料性附录)回 收 率本方法九种糖皮质激素的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1 九种糖皮质激素添加浓度及其平均回收率的试验数据GBT 22957-2008化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率o2 834o4 871泼尼松龙l_O 9375o 794o2 925o4 845泼尼松1o 82o5o 837o2 89 oo4 1001氢化可的松1o 10045o 9Io0 2 960o 4 894可的松1o 9855o 844o2 847o4 873甲基泼尼松龙1o 7995o 797o2 925o4 945倍他米松1o 8495o 766o2 891o4 918地塞米松1o 8295o 7811o 8942o 865倍氧米松5o 81325 82o1o 78o2o 775醋酸氟氢可的松5o 80525 814
