1、ICS 65120B 46中华人民共和国国家标准农业部1063号公告一52008饲料中9种糖皮质激素的检测液相色谱一串联质谱法Determination of glucocorticoids in feedsLiquid chromatography-tandem mass spectrometry2008-0715发布 20080715实施中华人民共和国农业部发布刖 罱农业部1 063号公告一52008本标准的附录A是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：河南省饲料产品质量监督检验站、国家饲料质量监督检验中心(北京)、
2、北京市饲料监察所。本标准主要起草人：班付国、贾振民、吴宁鹏、周红霞、郭芙蓉、宋志超、陈蔷、苏晓鸥、李兰、索德成、邓程君、卢光菊。1范围农业部1 063号公告一52008饲料中9种糖皮质激素的检测液相色谱一串联质谱法本标准规定了饲料中泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及预混合饲料中9种糖皮质激素单个或混合物的测定。本标准最低检出限为2 pgkg，最低定量限为5 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的
3、修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 20195动物饲料试样的制备GBT 146991饲料采样3原理试样中糖皮质激素类药物经甲醇振荡提取后，浓缩蒸干，溶解后用固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱法测定，外标法定量。4试剂和材料除特别注明者外，本法所用的试剂均为分析纯；水符合GBT 6682规定的一级水。4 1泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松对照品：纯度
4、均大于98oH。42甲醇：色谱纯。4 3乙腈：色谱纯。4 4甲酸：色谱纯。4 5二氯甲烷。4 6乙酸。4 7碳黑固相萃取柱：500 rag6 mL。4 8氨基固相萃取柱：500 mg6 mL。4 9洗脱液：二氯甲烷+甲醇(70+30，V。+U)。4 10 30乙腈溶液：乙腈。水溶液(30+70，Vl+U)。4 11标准储备液(1 mgmL)：准确称取适量泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松对照品，用乙腈分别配制成l mgmL的标准储备液，于一18以下保存，有效期为6个月。4 12混合标准储备液(100”gmL)：分别准确吸取泼尼松
5、龙、泼尼松、甲基泼尼松龙、氢化可的松、倍农业部1063号公告一52008氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可的松和醋酸可的松标准储备液(411)500 mL，置于50 mI。容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，于18。C以下保存，有效期为3个月。4 13混合标准工作液：准确吸取混合标准储备液(412)100mI，置于100mL容量瓶中，用30乙腈溶液(410)稀释至刻度，摇匀。取该溶液分别配制2 pgL、5 pgL、10 pgL、20,gI，、50 pgL、100,gLT_作液。于2。C8保存，有效期为1周。5仪器和设备5 1 高效液相色谱一串联质谱仪(配电喷雾离子源)。5 2涡旋振荡器。53
6、高速离心机。5 4振荡器。55旋转蒸发仪56电子天平：精度00001 g。57电子天平：精度001 g。5 8固相萃取装置。5 9氮气吹干浓缩仪。6试样制备6 1按GBT 146991的规定采样。62按照GBT 20195的规定制备试样。7测定步骤7 1提取称取试样50 g(准确至001 g)，置于50mL离心管中，加甲醇15mL，旋涡混合1rain，振荡提取15 min，6 000 rmin离心10 min，移取上清液。重复提取一次，合并上清液。于40。C下旋转蒸至近干。加入4 mL甲醇溶解残渣，再加入16 mL水，混匀。6 000 rmin离心10 min，移取上清液，备用。7 2净化取碳
7、黑固相萃取柱(47)依次用二氯甲烷、甲醇、水各6 mL活化，取备用液全部过柱。用1 mL甲醇淋洗，抽干。将预先用6 mL洗脱液(49)活化好的氨基固相萃取柱(48)串接在碳黑固相萃取柱下方。6 mL洗脱液(49)洗脱，收集洗脱液，于60。C下氮气吹干。残余物用30乙腈溶液(410)05mL溶解，涡旋混匀，6 000 rmin高速离心10 min，取上清液适量，供液相色谱串联质谱仪测定。73测定7 3 1液相色谱参考条件a)色谱柱：BEH C18(100mmX 21mm，17“m)，或相当；b)流动相；A相：乙腈；B相：01甲酸水溶液；c)流速：03 mLrain；d)柱温：30；c)进样量：5
8、 gI。；f)梯度洗脱条件见表1。2表1梯度洗脱条件农业部1 063号公告一52008时间 A相 B相rain O 25 758 35 659 80 20lO 25 7512 25 757 3 2质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：负离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)源温：110；e)雾化温度：300；f)锥孔气流速：50 I。h；g)雾化气流速：650 Lh；h)碰撞室压力：3510 3mbar；i)毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等应优化至最优灵敏度j)检测离子对见表2。表2 9种糖皮质激素的参考保留时间和I-M-I-HCOO一离子、特征离子保留时间 M+HCOO 特征
9、离子药物名称泼尼松龙 353 4053 329 4a 3594泼尼松 359 4034 327 3a 3572甲基泼尼松龙 5 29 4194 3434a 3733氢化可的松 365 407 4 331 38 3613倍氯米松 637 4534 377 4a 407 3地塞米松 556 4374 36148 3913倍他米松 577 4374 361 48 391 3醋酸氟氢可的松 807 4674 4214a 3494醋酸可的松 900 447 5 329 2a 4011注：a定量离子。73 3液相色谱一串联质谱测定7 3 3 1定性测定每种被测组分选择1个EM+HCOO离子和2个以上特征离
10、子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物质。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对丰度 50 2050 1020 10允许偏差， 20 25 土30 士507 3 3 2定量测定农业部1 063号公告一52008在仪器最佳工作条件下，对混合标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，混合标准溶液浓度为横坐标绘制工作曲线，用单点或多点对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性
11、范围内。上述色谱和质谱条件下，标准品特征离子质量色谱图参见图A1。734平行试验按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定。7 3 5回收率试验阴性样品中添加标准溶液，按样品测定步骤操作，测定后计算样品添加的回收率。7 3 6空白试验称取空白试样，按样品测定步骤操作，同时完成空白试验。8结果计算和表述试样中被测组分含量按式(1)计算：x一警等式中：x试样中糖皮质激素类药物的含量，单位为微克每千克(tgkg)P；试样溶液峰面积响应值；V样品的总稀释体积，单位为毫升(mL)；Ci标准溶液浓度，单位为微克每升(t,gL)；P。标准溶液峰面积响应值；m试样质量，单位为克(g)；平行测定结果用算术平均值表示
12、，保留3位有效数字。9重复性在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于20。附录A(资料性附录)标准物质特征离子质量色谱图农业部1 063号公告一52008MRM 0f 16 Channels ES一100】 啭1U 4674421 41- 212e40L，T，r，P，1，1，T，P，1，T，r，1，1，r，r，r，1，1，T，T，_，3_，1，T，T一3 50 4 00 4 50 5 00 5 50 6 00 6 50 7 00 7 50 800 8 50 9 00MRM 0f 16 Channels ES一2345678注：l醋酸氟氢可的松特征离子质量色谱图(467424214)；2 倍氧米松特征离子质量色谱图(453t2377 4)；3醋酸可的松特征离子质量色谱图(447 52329 2)；4地塞米松、倍他米松特征离子质量色谱图(437 42361 4)；5甲基泼尼松龙特征离子质量色谱图(419 42343 4)；6氢化可的松特征离子质量色谱图(4074233l_3)；7泼尼松龙特征离子质量色谱图(405323294)；8 泼尼松特征离子质量色谱图(i03 423273)。图A 1 标准物质特征离子质量色谱图ESES一5
