1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部1163号公告一52009动物性食品中氨苄西林残留检测高效液相色谱法lligll performance liquid chromatographic method fordetermination of Ampicillin residues in edible tissues20090206发布 20090301实施中华人民共和国农业部发布刖 舀农业部1 163号公告52009本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准由华中农业大学负责起草。本标准主要起草人：袁宗辉、陈冬梅、陶燕飞、王玉莲、刘振利、黄玲利
2、、彭大鹏、戴梦红。本标准系首次发布的国家标准。1范围动物性食品中氨苄西林残留检测高效液相色谱法本标准规定了动物可食性组织和牛奶中氨苄西林残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪、牛、鸡的肌肉，猪的肝脏和肾脏、牛的肾脏及牛奶中氨苄西林残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3制样取新鲜或冷冻空白、供试
3、组织，去除筋膜，绞碎，混匀，一20以下贮存。牛奶样品置于2。C8贮存。4测定方法4 1方法提要或原理肌肉样品用磷酸缓冲液提取，肝脏和肾脏样品先用乙腈再用磷酸缓冲液提取，牛奶样品用四丁基溴化铵溶液提取。提取液用固相萃取柱净化，用1，z，4三睦和氯化汞溶液衍生，供高效液相色谱(紫外检测器)测定，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂。水符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1甲醇：色谱纯。422乙腈：色谱纯。4 2 3二水磷酸二氢钠(NaHzP042HzO)。4 2 4正己烷。4 2 5无水磷酸氢二钠。426氢氧化钠。4 2 7硫酸氢化四丁基铵。4 2 8五水硫
4、代硫酸钠(Na2S2035HzO)。429 1，z，4三氮唑。4 2 10氯化钠。4 2”氯化汞(HgC!z)。4 212四丁基溴化铵。4 2 13 C18固相萃取柱：500mg，3mL。1农业部1 163号公告一520094214流动相A相：称取无水磷酸氢二钠50 g、二水磷酸二氢钠100 g、无水硫代硫酸钠40 g、硫酸氢化四丁基铵65 g，用适量的水溶解，定容至1 000 mL。B相：乙腈。4215磷酸盐缓冲液01 toolL称取无水磷酸氢二钠142 g，用适量的水溶解，稀释到1 000 mL，2。C8保存。4216四丁基溴化铵溶液0 01 molL称取四丁基溴化铵32 g溶解于乙腈中，
5、定容到1 000 mL，28保存。4 2 17氯化钠溶液0 3molL称取氯化钠200 g，溶解于适量水中，稀释到1 000 mL，室温保存。4218标准稀释液量取流动相A 50 mL，用2 molL氢氧化钠调节pH至8o，然后与乙腈等体积混合，现配现用。42 19苯甲酸酐溶液0 2molL称取苯甲酸酐2262 g，用适量乙腈溶解，定容到50 mL，28保存。4220氯化汞(1qlgCl2)溶液0 1 molL称取氯化汞(HgCl。)o271 5 g，用适量水溶解，稀释并定容到10 mI。，现配现用。4221衍生化试剂称取1，2，4三唑1378 g，用水60 mL溶解，加入氯化汞溶液10 mL
6、，用5 toolL NaOH溶液调节pH至90，用水稀释到100 mI，2。C8避光保存。4 2 22氨苄西林对照品含量不少于97。4 2 23氨苄西林标准储备液准确称量相应质量氨苄西林标准品100 mg，用水溶解并定容至10 mL，得到1 nagmL的标准储备液。一18以下避光保存，有效期1个月。42 24氨苄西林标准工作液的配制取氨苄西林标准储备工作液10 mL于100 mI。容量瓶中，用标准稀释液稀释，定容至100 mL，配制成质量浓度为001 mgmL的标准工作液，现配现用。43仪器和设备4 3 1 高效液相色谱仪(配紫外检测器)。4 32分析天平。4 33离心机。43 4冷冻高速离心
7、机。4 35恒温水浴锅。4 3 6旋涡混合器。4 3 7固相萃取装置。4 3 8超声波清洗机。43 9组织匀浆机。4 3 10氮气吹干装置。44测定步骤44 1试料的制备试料的制备包括：取均质后的供试样品，作为供试试料；取均质后的空白样品，作为空白试料。4 4 2提取称取肌肉试料5o g，置于50mI，玻璃离心管中，加磷酸缓冲液15mL，振荡5mln混匀，加正己烷5 mL，振荡混匀，3 000 rrain离心15 min，弃掉正己烷层(上层)，转移水层(中间层)至另一洁净玻璃离心管中；然后，用磷酸盐缓冲液10mL和正己烷5mL重复提取2次，除去正己烷层，合并3次的提取液(水层)供SPE净化。称
8、取肝脏或肾脏试料50 g，置于50mL离心管中，加入乙腈20mL，混匀，再加入正己烷5mL，混匀，静置5 min，3 000 rmln离心15 min，除去正己烷层，转移乙腈层至另一离心管中。残渣中加入磷酸盐缓冲液10mL和正己烷5mL，混匀，静置，3 000 rmin离心15mln，除去正己烷层，水层与乙腈层合并，供SPE净化。量取牛奶样品50mL置于离心管中，加四丁基溴化铵溶液10 mL轻摇混匀，3 000 rmin离心10min，取上清液，再按上述操作重复2次。合并3次上清液，加正己烷10mL。振荡混匀，静置10min，除去正己烷层，在45。C50。C水浴旋转蒸发至3mL4mL，供SPE
9、净化。443净化固相萃取柱依次用甲醇、水、氯化钠溶液和磷酸缓冲液各3 mL活化，将提取液过Cts固相萃取柱，用水1mL淋洗、乙腈3mL洗脱，用10mI。的玻璃离心管收集洗脱液，45C50。C水浴氮气吹干。4 4 4衍生化反应洗脱液45C氮气吹干，加标准稀释液05 mL旋涡振荡溶解，转入1_5 mL聚丙烯离心管中，加苯甲酸酐溶液25 pL，旋涡混匀，50C水浴反应5 min，冰浴、快速冷却，加衍生化试剂250 ttL，旋涡混匀，65。C水浴反应10 min，快速冰浴冷却，4。C 10 000 rmin离心10 min，取上清液供高效液相色谱分析。4 4 5标准曲线的制备用标准稀释液稀释得到氨苄西
10、林浓度分别为10 ugL、25 ugL、50 ugL、100 UgI。、250 ugL、500 ugL、1 000ugL、1 500ugL标准溶液。取标准液05mL，按照444步骤进行衍生，高效渡相色谱分析，每个浓度重复3次，将每测得的峰面积与对应浓度拟合，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。446测定4461色谱条件色谱柱：c8柱，柱长150 mm，内径39 mm，粒径5“m；或相当者；流动相：A相+B相一65+35；流速：1 mLmin；紫外检测波长：325 m；柱温；30；进样量：50”L。4 4 6 2色谱测定取衍生后的溶液和相应的标准溶液，做单点或多点校准，按外标法，以峰面积定量。4
11、 5空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。46结果计算和表述4 6 1试料中氨苄西林的残留量(pgkg)按式(1)计算： X一糌(1)式中：X试料中氨苄西林残留量，单位为微克每千克或微克每升(ugkg或gL)A试样溶液中氨苄西林衍生物的峰面积；As标准工作液中氨苄西林衍生物的峰面积；G标准工作液中氨苄西林的浓度，单位为微克每升(ugL)；y试样溶液体积，单位为毫升(mL)；w组织样品质量或牛奶样品体积，单位为克或毫升(g或mL)。5检验方法灵敏度、准确度、精密度51灵敏度本方法氨苄西林的检测限为5 ugL；在猪和牛的肌肉、肾脏组织，猪的肝脏和鸡的肌肉组织中的定量限为10“gk
12、g；在牛奶中的定量限为4,gL。52准确度本方法在猪和牛的肌肉、肾脏组织，猪的肝脏和鸡的肌肉组织中添加浓度为10 ugkg100“gkg，牛奶中添加浓度为420 ugkg的回收率均为70110。53精密度本方法批内、批间变异系数CV20。4附录A(资料性附录J高效液相色谱图农业部1 163号公告52009图A1 氨苄西抹标准溶液(25 pgL)衍生物色谱图图A 2猪肾脏样品空白色谱图图A 3猪肾脏添加氨苄西林(10 pgkg)衍生物色谱图农业部1 163号公告一52009i，。，+Il卜。，、一，一。一。一 I5 00 1000图A 4牛奶样品空白色谱图图A5牛奶添加氨苄西林(4 I曙L)衍生物色谱图
