1、ICS 67050X 04 a雪中华人民共$-n国国家标准GBT 22975-2008牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和双氯西林残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of amoxicillin，ampicillin，piperacillin，penicillin G，penicillin V，oxacillin，cloxacillin，nafcillin，dicloxacillin residuesin milk and milk powder-LCMSMS method200812-31发布 2009050 1
2、实施宰瞀燃紫瓣警矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“1”刖 昌C-BT 22975-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。本标准主要起草人：段文仲、贾海涛、艾连峰、陈瑞春、郭春海、马育松、刘宝圣、崔奕杰、庞国芳。牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和双氯西林残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22975-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、
3、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、奈夫西林和双氯西林残留量的高效液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、奈夫西林和双氯西林残留量的测定和确证。本标准的方法检出限：牛奶中氨苄西林、奈夫西林为1 pgkg，阿莫西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素v、氯唑西林为2#gkg，苯唑西林、双氯西林为4 pgkg；奶粉中氨苄西林、奈夫西林为8 pgkg，阿莫西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素v、氯唑西林为16 Ngkg，苯唑西林、双氯西林为32gkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文
4、件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6379，1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 637912004，IS0 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696
5、：1987，MOD)3原理用乙腈一水溶液提取试样中的分析物，固相萃取柱净化，高效液相色谱一串联质谱测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41乙腈：液相色谱纯。42乙酸：液相色谱纯。43磷酸氢二钠。44氢氧化钠。45 5 molL氢氧化钠溶液：100 g氢氧化钠(44)溶解于450 mL水中，加水定容至500 mL。46 01 molL磷酸盐缓冲溶液：6 g磷酸氢二钠(43)溶解于450 mL水中，用氢氧化钠溶液(45)调节pH=8，加水至500 mL，使用前配制。47乙腈一水溶液(3+1)：300mL乙腈(41)与100mL水混合。G
6、BT 22975-200848乙腈一水溶液(1+1)：100 mL乙腈(41)与100 mL水混合。49阿莫西林(CAS：2678778一o)、氨苄西林(CAS：69534)、哌拉西林(CAS：61477961)、青霉素G(CAS：69578)、青霉素V(CAS：132989)、苯唑西林(CAS：7240382)、氯唑西林(CAS：642784)、奈夫西林(CAS：7177506)和双氯西林(CAS：3116765)九种青霉素标准物质，纯度均大于等于98。410标准储备液：分别适量称取标准品(精确至0000 1 g)，用乙腈一水溶液(48)配制成100zgmL的标准储备液。411混合标准中间工
7、作液：取标准储备液(410)各1 mL至100 mL容量瓶中，用乙腈一水溶液(48)定容至刻度，配制成混合标准工作液，浓度为1 pgmL。412标准工作液：根据需要，吸取一定量的混合标准中间工作液(411)，用空白样品提取液稀释至所需浓度，现用现配。413 HLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL磷酸盐缓冲溶液(4，6)活化。414滤膜：02“m。5仪器和设备51高效液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52分析天平：感量为001 g。53离心机。54旋涡混合器。55旋转蒸发仪。56固相萃取装置。57 pH计。6试样的制备与保存61 牛
8、奶取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封置4C下保存，并标明标记。62奶粉取均匀样品约250 g装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。7测定步骤71提取牛奶样品称取约4 g(准确至001 g)于50 mL具塞离心管中，奶粉样品称取约05 g(准确至0ol g)并加入4 mL水于50 mL具塞离心管中，混匀。加入20 mL乙腈一水溶液(47)高速振荡提取2 min后，3 000 rrain离心10 min，移取上清液过滤至鸡心瓶中。冉用10 mL乙腈一水溶液(47)重复提取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。72净化将提取液于45下旋转蒸发至约7 mL左右，加入2 mL磷酸盐缓冲液(46
9、)，混匀后，转移到已活化的HLB固相萃取柱上，再用z mL磷酸盐缓冲液(46)洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到柱上，控制流速小于2 mLmin。用3 mL水淋洗并抽干萃取柱，用4 mL乙腈一水溶液(48)洗脱并收集于10 mL带刻度的玻璃管中(控制流速小于2 mLmin)。用水定容至40 mL，涡旋混合后，过022 pm滤膜供HPLC-MS_MS分析。73空白基质溶液的制备将取牛奶阴性样品4 g，奶粉阴性样品05 g(精确到001 g)，按71和72操作。274测定条件74I液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：苯基柱，5 ffm，150 ram21 mm(内径)或相当者b)色谱柱温
10、度：30；c)进样量：15 pL；d) 流动相梯度及流速见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件GBT 22975-2008时间rain 流速(aLmin) 01甲酸水溶液 甲醇000 200 80 20600 200 20 80800 200 20 80801 200 80 20100 200 80 20742质谱参考条件质谱参考条件如下：a) 离子化模式：电喷雾正离子模式(EsI+)b)质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；c)鞘气压力：208 kPa；d)辅助气压力：55 kPa；e) 正离子模式电喷雾电压(Is)：4 000 V；f)毛细管温度：320；g)源内诱导解离电压：10 V；h)Ql为
11、04，Q3为07；i)碰撞气：高纯氩气；j)碰撞气压力：02 Pa；k)其他质谱参数见表2。表2被测物的参考保留时间、采集窗口、监测离子对和裂解能量化合物名称 保留时间min 采集窗口rain 监测离子对(mz) 裂解能量ev阿奠西林 3660811386 22217 035amoxicillin 36608348 87 10氨苄西林 3500810594 20526 3558ampicillin 3500815991 13哌拉西林 51807142 92 34666 5812piperacillin 51807159941 12青霉素G 33508115986 12685 5812penic
12、illin G 3350817591 14青霉素v 3510711381 33711 5812penicillin V 35107159924 11GBT 22975-2008表2(续)化合物名称 保留时间rain 采集窗口rain 监测离子对(mz) 裂解能量eV苯唑西林 4020815985 12737 5812oxacillin 4020824281 15氯唑西林 4360416001 12767 5812cloxacillin 4360427685 16萘夫西林 4151017090 36776 5812nafcillin 4151019896 13双氯西林 470oo159 98 1
13、3804 5812dicloxaclllln 4700031078 183为定量离子对，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在土25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20gkg)c从标准
14、工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；v样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度GBT 22975-200891一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，牛奶和奶粉中九种青霉素的添加浓度范围及重复性方程见表4和表5。表4 牛奶中九种青霉素的添加浓度及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范雷 重复性限r 再现性限品阿莫西
15、林 220 r一0143 8m一0123 0 lgR一0 879 8lgm 0753 5氨苄西林 1lO lg r一0800 3lgm一0705 4 lgR一0 847 2Igm一0566 3哌拉西林 220 19 r一0672 0lgm一0487 6 lgR一0 544 8lg0 2461青霉素G 220 19R0 591 5 IgmO361 3 R一0135 7晰+0611 3青霉素V 220 19 r一0 719 5Igm 0585 0 lgR一0 710 4lgm 0523 2苯唑西林 440 r一0 1 67 9 m 0446 4 R一0162 5小0 046 5氯唑西林 220 r
16、一0076 7仇+03501 lgR一0 792 5lg0 435 0萘夫西林 110 同0 131 2卅一0002 3 R一0141 5州+0 129 6双氯西林 440 r一0184 6m+0119 6 lgRO792 5Igm 0 4491注：m为两次测定结果的算术平均值。表5奶粉中九种青霉素的添加浓度及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R阿莫西林 1 6160 刚0 145 6 m一0998 2 IgR一0867 9lgm 0544 2氨苄西林 880 r一0143 6 m+0 003 9 19R一0630 6lg0 277 3赈拉露林
17、i6160 R0 659 7扰+1，689 5 培R=O638 9lgm 0268 2青霉素G 16160 lg r一0886 919研一0 714 4 19RO705 8lgm一0388 8青霉索v 16160 lg r=053 lgm 0 19 lgR=0689 5lgm一0363 3苯唑西林 32320 r一0074 8 m+1040 3 R一0087 8m+0 740 8氯唑西林 16160 19 r=0 687 9 lgm-0489 8 lgR一1007 6IgmO892 4萘夫西林 880 r一0044 6 m+2109 0 lgR一0392 6 lgm+0071 6双氯西林 32
18、320 r一0056 4m+3236 5 lgR一0740 9 lgm一0370 6注：优为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，牛奶和奶粉中九种青霉素的添加浓度范围及再现性方程见表4和表5。GBT 22975-2008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图九种青霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。RT：0 00-12 00 RT：000 12 00“j “r 100、RT： 100 ”j 69j l50w1。嘉着飘。5 50J 阿
19、莫西林 so“j。氯04畦1西60林0。5j lu366 08113 86j 8lDo菇1 RT： r 67loo、 ”：?85 1：r阿莫西林 J 氧唑西林j 青霉素G503350817 591； 366 0834887 50j 436 04276851 i 妻 100” ”： I 100菇、 RT 8 061：r氨苄西林 量 j 苯唑西林 薯 取氧西林35008105 94 三 4020815985i 50j i 50 47“00159982，00老i RT： 100菇、 RT j 0450r氨苄西林 j 苯唑西林 J 取氯西林350 09159 91 50J 402 08242 81 5
20、0470 0031078l100菇、 m 7 11 loo菇、 ”： r 74 u100J 青霉素v J 萘夫西林一一 哌拉西林50j 351 07159 92 504151017090 50一 518 0715994i 0r：6 66loo菇 ” ，1l 100菇 ”： _76100一J 青霉囊v J 萘夫西林 哌拉西林518 07142 9250d 3510711381 50j415 10198 96 50 I L、0。 4 1扩 o 。 1 0 F 。1图A1 九种青霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图附录B(资料性附录)回收率九种青霉素添加浓度及其回收率的试验数据，见表B1。表B1
21、九种青霉素添加浓度及其回收率的试验数据GBT 22975-2008牛 奶 奶 粉化合物名称添加浓度(pgkg) 回收率范围 添加浓度(pgkg) 回收率范围2 7551023 16 75o10634 8321013 32 8671033阿奠西林10 803948 80 913103220 744100 7 160 8499881 7541074 8 67110252 708893 16 86 21024氨苄西林5 706818 40 89O96910 779951 80 865100 22 69 81082 1 6 75110934 7111019 32 7911056哌拉西林10 72910
22、24 80 76398720 8689728 160 8689892 6951059 16 74 510124 781lOO6 32 7591047青霉素G10 702965 80 78099620 7811006 160 8959812 7851032 16 71710784 7751082 32 8341053青霉素V10 8771084 80 76297320 873958 160 84710024 7671087 32 79 598 38 9001045 64 88891068苯唑西林20 838100 8 160 871108340 8269851 320 8419812 64510
23、22 16 70310484 7461035 32 7461088氯唑西林10 766953 80 814102220 844980 160 855971GBT 22975-2008表B1(续)牛 奶 奶 粉化合物名称添加浓度(pgkg) 回收率范围 添加浓度(pgkg) 回收率范围1 6241146 8 74898 02 816981 16 706795O萘夫西林5 822952 40 83597410 846988 80 8909694 7061048 32 76o106 98 8441097 64 7461062双氯西林20 74 61067 160 808101840 826986 320 848987
