1、ICS 67.050 x 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 830 -2004 动物性食品中阿莫西林残留检测方法HPLC The determination of amoxicillin in edible animal tissues -HPLC method 2004一08-25发布060727000277 2004-09一01实施中华人民共和国农业部发布NY /T 830-2004 目。吕本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位:农业部畜禽产品质量监督检验测试中心、北京师范大学分析测试中心。本标准主要起草人:单吉浩、谢孟峡、刘素英
2、、杨清峰、薛毅、吴银良、王诲。I 1 范围动物性食品中阿莫西林残留检测方法一高效液相色谱法(HPLC)NY /T 830-2004 本标准规定了动物性食品中阿莫西林残留量检测的制样和高效液相色谱的测定方法。本标准适用于猪肌肉、猪皮、猪皮下脂肪和鸡肌肉中阿莫西林的残留量检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新文本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBIT6682 分析实验室用水规则和实验方法3 制样
3、3.1 样晶的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使之均匀。3.2 样品的保存一20C以下冰箱中贮存备用。4 测定方法4.1 方法提要或原理匀浆后的试样经过磷酸提取液提取和兰氯乙酸沉淀蛋白，过C18固相萃取柱净化，用合适的溶剂选择洗脱，经过衍生化，供高效液相色谱定量(紫外检测器)测定。外标法定量。4.2 试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂;水为符合GBIT6682规定的二级水。4.2.1 阿莫西林含阿莫西林(C16H19N30SS)不得少于98.9%。4.2.2 三氯乙酸4 . 2 . 3 1, 2, 4-三瞠4.2.4 氯化柔4.2.5 乙腊:色谱纯4.2.6 甲醇
4、:色谱纯4.2.7 磷酸二氢铀4.2.8 磷酸氧二铀4.2.9 丽代前酸铀4.2.10 氢氧化铀4.2.11 乙酸酶NY IT 830-2004 4.2.12 氢氧化铀溶液5.0mollL 取氢氧化饷饱和溶液14mL，加水稀释至100mLo 4.2.13 磷酸缓冲液0.05mollL 取磷酸氢三铀6.28g，磷酸二氢铀5.11g，硫代硫酸纳3.11g，加水使溶解，并稀释至1000mLo使用前，过0.45m滤膜。4.2.14 氯化宗溶液0.026mollL 取氯化隶0.072g，加水使溶解，并稀释至10mLo4.2.15 乙酸西溶液0.20mollL 取乙酸西干0.1mL，加乙睛稀释至5mLo4
5、.2.16 衍生化试剂取1，2，4一三略1.37g加6mL水使恪解，加1mLO.026 mol几氯化隶溶液，用5.0mollL氢氧化铀熔液调pH至9.0，tO水稀释至10mLo随配随用。4.2.17 磷酸氢二纳溶液0.025mollL 取磷酸氢二饷0.22g，加水使溶解，用5.0mollL氢氧化铀溶液调pH至9.0，加水稀释至50mLo4.2.18 提取液取磷酸二氢铀1.68g，加水使溶解，用磷酸调pH至4.5，加水稀释至500mLo 4.2.19 三氯乙酸溶液75%wlv)取三氯乙酸7.5g，加水使溶解并稀释至10mLo 4.2.20 三氯乙酸溶液2%wlv)取三氯乙酸2.0g，加水使溶解并
6、稀释至100mL。4.2.21 阿莫西林标准储备液准确称取阿莫西林对照品25mg，加水使溶解并稀释至浓度约为1.Omg/mL的储备液，置于2C 8C冰箱中保存，有效期1个月。4.2.22 阿莫西林标准工作液准确量取适量阿莫西林标准储备液，用水稀释成适宜浓度的阿莫西林标准工作液。4.3 仪器和设备4.3.1 高效液相色谱仪自己紫外检测器)4.3.2 分析天平感量0.0001go 4.3.3 天平感量O.Olgo4.3.4 涡旋震荡混合器4.3.5 组织匀浆机4.3.6 50 mL离心管4.3.7 固相萃取装置4.3.8 离心机4.3.9 固相萃取柱C18100 mg/mL，含碳量关16%04.3
7、.10 氯气吹干装置4.3.11 恒温水浴锅4.3.12 滤膜0.45m，水相。4.4 测定步骤4.4.1 试料的制备试料的制备包括:一一取绞碎后的供试样品，作为供试材料。一一取绞碎后的空白样品，作为空白材料。一一取绞碎后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4.4.2 提取NY IT 830-2004 称取(5:t0.05) g试料，置于30mL匀浆杯中，加10mL提取液，10000 r/min匀浆1min，匀浆液转入50mL离心管中，振荡混合5min,4000 r/min离心lOmin，上清液转入另一25mL离心管中。用提取液5mL洗刀头及匀浆杯，转入50mL离心管洗残渣，搅
8、匀，振荡，离心。合并上清液于25mL离心管中，加人0.5mL 75% (/)三氯乙酸榕液，涡旋震荡20s,4 000 r/min离心lOmin，上清液做备用液。4.4.3 净化C18固相萃取性依次用5mL甲醇，2mL水和2mL2%( wl)三氯乙酸溶液润洗。将备用液过C18柱，依次用2mL2%( wlv)三氯乙酸榕液和2mL水洗，真空抽干。用3mL乙脯洗脱，真空抽干，收集洗脱液。在样液过性和洗脱过程中流速控制在1mL/min左右。4.4.4 衍生化反应洗脱液在40c下氮气吹干，加0.2mL水和0.2mL 0.025 mol/L pH为9.0的磷酸氢二饷缓冲榕液，涡旋振荡使其洛解。加0.05mL
9、 0.2 mol/L的乙酸酣乙腊溶液，室温下反应10min后，加0.55mL 衍生化试剂，密封，涡旋氓匀，于60c恒温水浴中衍生反应1h。衍生结束后冷却至室温，溶液用滤膜过滤，作为试样溶液，供高效液相色谱分析。4.4.5 标准曲线的制备准确量取适量阿莫西林标准工作液，用水稀释成浓度分别为0.05周ImL，O.1O月ImL，0.25周/mL，0.50阅ImL，1.00周ImL的阿莫西林标准榕液。各准确量取0.20mL，按衍生化反应步骤衍生，得到系列浓度的阿莫西林衍生化产物。将溶液滤膜过滤，供高效液相色谱分析。4.4.6 测定4.4.6.1 色谱条件色谱柱:C18250 mmX 4.6 mm(i.
10、d.)，粒径5m，或相当者O流动相:0.05mollL磷酸盐缓冲液乙腊(84+ 16)，用前过滤膜。流速:1 .0 mL/mino 检测波长:323nmo 进样量:20Lo4.4.6.2 测定法取适量试样溶液和相应的标准工作陪液，做单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中的阿莫西林衍生物响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，阿莫西林衍生产物的保留时间在7.20min左右，标准榕液和试样溶液衍生化产物的掖相色谱图见附录Ao4.4.7 空白实验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4.5 结果计算和表述试料中阿莫西林的残留量(gll唔):按式(1)计
11、算。AxC弓xVX l (1) AsX儿f3 NY /T 830-2004 式中:X一一试料中阿莫西林的残留量，单位为纳克每克(ng/g); A一一试样溶液中阿莫西林衍生物的峰面积;As一一标准工作液中阿莫西林衍生物的峰面积;Cs一一标准工作液中阿莫西林的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL); V一一试样溶液体积体积，单位为毫升(mL);M一一组织样品的质量，单位为克(g)。注:计算结果扣除空白试料值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留至小数点后2位。5 检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1 灵敏度本方法在猪肌肉、猪皮、猪皮下脂肪和鸡肌肉中的检测限为10glkgo5.2 准确度本方法在1
12、0glkg200glkg添加浓度的回收率为70%110%。5.3 精密度本方法的批内变异系数CV10%，批间变异系数CV运15%。4 0.0003 军0.0002二0.0001 0.00020 0.00018 0.00016 0.00014 t: 0.000 12 0.00010 0.00008 0.00006 0.00005 -0.00000 ;:J -0.000 05 -0.00010 -0.00015 -0.00020 NY /T 830-2004 1.00 2.00 3.00 附录A(资料性附录)高效液相色谱圄6.00 7.00 8.00 Minutes 圄A.l阿真西林标准溶液衍生化
13、物的液相色谱图10.00 11.00 12.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 Minutes 图A.2猪肌肉组织中阿莫西林衍生化产物液相色谱图11lililllllillllllllllijiil 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 Minutes 圄A.3鸡肌肉组织中阿莫西林衍生化产物液相色谱图5 NY /T 830-2004 0.00010 0.00005 -: 0.00000 -0.00005 -0.0
14、0010 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 肌1inutes图A.4猪皮组织中阿莫西林衍生化产物液相色谱图0.00015 0.00010 二=: 0.00005 0.00000 -0.00005 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 Minutes 图A.5猪皮下脂肪组织中阿真西林衍生化产物液相色谱图6 叮CON-ogH问Z中华人民共和国农业行业标准动物性食品中阿莫西林残留检测方法一-HPLCNY /T 830-2004 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)争夺* 争夺网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销(邮政编码:100026 * 争毛争令字数8千字2005年1月北京第1次印刷印数:1-2000册印张0.75开本880mmx1230mm 1/16 2005年1月第1版书号:16109. 388 定价:8.00元版权专有僵权必究举报电话:(010) 65005894 NY厅830-2004
