1、ICS 67100X 16中华人民共和国国家标准农业部958号公告一12007牛奶中替米考星残留量的测定高效液相色谱法Determination of filmicosin residues in milkHigh performance liquid chromatography20071229发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布前言1范围2规范性引用文件-3制样31样品的制备32样品的保存4测定方法41方法提要或原理42试剂和材料43仪器和设备44测定步骤45结果计算和表述-5检测方法灵敏度、准确度和精密度51灵敏度-52准确度53精密度附录A(资料性附录)高效液相色谱图目
2、次农业部958号公告一12007农业部958号公告一12007刖 吾本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准主要起草单位：河南省兽药监察所。本标准起草人：班付国、吴宁鹏、周红霞、张发旺、贾振民、宋志超、郭芙蓉、刘素梅、陈蔷、杜红鸽。1范围牛奶中替米考星残留量的测定高效液相色谱法农业部958号公告一12007本标准规定了牛奶中替米考星残留量检测的制样和高效液相色谱的测定方法。本标准适用于牛奶中替米考星残留量的测定。2规范性引用文件下列文件的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，
3、然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注El期的引用文件，其最新版本适用于本标准。6BT 11 2000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则(Is0IEC Directives，Part 3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)C,BT 6682 1992分析实验室用水规格和试验方法农业部农牧发20031号兽药残留试验技术规范(试行)3制样3 1样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试牛奶样品，摇匀。3 2样品的保存20以下贮存备用。4测定方
4、法4 1方法提要或原理用乙腈提取牛奶中的替米考星，经c，s固相萃取柱净化，溶剂洗脱，氮气吹干，溶解残余物，用高效液相色谱紫外检测法测定。外标法定量。42试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯；水应符合GBT 6682规定的一级水。421替米考星对照品，纯度903。4 2 2乙腈：色谱纯。4 2 3甲醇：色谱纯。4 2 4四氢呋喃：色谱纯。425磷酸。4 2 6二丁胺。4 2 7乙酸铵。4 28 1moI。L磷酸二丁胺缓冲液(DBAP)：量取水700mL，加入二丁胺168mI。，然后缓慢加入磷酸约70 mL，搅拌使二丁胺溶解，冷却至室温。调pH至25-26(以每次l mL2 mI。的
5、量加入磷酸约18 mI。)。加水稀释至l 000 mL，过滤，备用。1农业部958号公告一120074 2 9洗脱液：称取乙酸铵771 g溶解于甲醇200 rnL中，加入乙腈790mI，冷却至室温，用乙腈稀释至1 000mL。4 210替米考星标准贮备液：将替米考星对照品在60。C减压干燥3 h，精密称取25 mg(按标示量计)，置25mI。棕色量瓶中，用乙腈溶解、定容，制成1mgmL的标准贮备液，4以下避光保存。有效期3个月。4 2 1 1替米考星标准工作液：准确量取标准贮备液适量，用流动相稀释成适宜浓度的标准工作液。临用前配制。4 3仪器和设备4 31高效液相色谱仪(配紫外检测器)。4 3
6、2分析天平：感量0000 01 g。4 3 3聚丙烯离心管：50mL。434 Waters C18固相萃取柱：500 rag6 mL(或相当者)。435漩涡混合仪。4 3 6离心机。4 3 7固相萃取装置。4 4测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取摇匀后的供试样品，作为供试试料。一一取摇匀后的空白样品，作为空白试料。取摇匀后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 4 2提取量取试料5 mL于离心管中，加入乙腈15 mI，涡旋混合30 s，超声1 min，以6 000 rmin离心5min，将上清液转入150mL锥形瓶中，加水50mL稀释，备用。443净化C，。固相萃取
7、柱依次用甲醇lo m1、水lonlI，活化，将提取液过柱，依次用水10“。、乙腈10mL洗涤，抽干5min，用洗脱液5mL洗脱，30 oc水浴下氮气吹干。用流动相1omL溶解残留物，o22 p。微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱分析。4 4 4标准曲线的制备准确量取标准工作液适量于棕色量瓶中，用流动相稀释为50、100、250、500、1 000 egL浓度的标准工作液，供高效液相色谱仪分析，以测得替米考星的顺式与反式异构体峰面积之和为纵坐标，相应的替米考星浓度为横坐标绘制标准曲线，计算曲线的回归方程及相关系数。4 45测定4 4 5 1色谱条件色谱柱：XBridgeCl8柱，粒度5 pm，46
8、mmXl50 mm(或相当者)。流动相：取110mL乙腈、55mL四氢呋喃和25mLltooLLDBAP，加人700mL水中，用水稀释至1 000 mL，滤过，脱气，即得。柱温：30。流速：10 mI。min。检测波长：280 nm。进样量：50“L。2农业部958号公告一12007445 2测定法取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积定量，即得。替米考星标准溶液色谱图和试样溶液色谱图分别见附录A中图A1和图A2。4 4 G空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。45结果计算和表述按式(1)计算试料中替米考星的残留量(tgL)x：墼型孕型(1) A5
9、m式中：X试料中相应替米考星的残留量，“gL；Ai试样溶液中替米考星顺式与反式峰面积之和；cs一标准工作液中替米考星的浓度，f,gL；As标准工作液中替米考星顺式与反式峰面积之和； m试样的量，mI。；v溶解残余物体积，mL。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度和精密度5 1灵敏度本方法牛奶中的检测限为5 pgI。，定量限为25 pgL。5 2准确度本方法在25“gL100gL添加浓度的回收率为70110。5 3精密度本方法的批内相对标准偏差10，批间相对标准偏差10。农业部958号公告一12007附录A资料性附录)高效液相色谱图 nj11 j f1 l |l j1 一1r H oL一一一LL一j J川 II 1fl I】f 【fj 12 00 400 6 00 8 00 10 00 12 00 14mMinules1替米考星反式异构体色谱峰2替米考星顺式异构体色谱峰Z图A 1 替米考星标准溶液色谱图1替米考星反式异构体色谱峰2替米考星顺式异构体色谱峰Minutes图A 2空白牛奶添加标准溶液色谱图黑黜裟黜慧眦吡吡们鲫“加加加埘加
