1、ICS 67040x 00中华，人民 共禾口 国国家标准农业部1025号公告一102008动物性食品中替米考星残留检测高效液相色谱法Determination of tilmicosin residue in animal derived foodHigh performance liquid chromatographic method2008-0429发布 2008-0429实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部1 025号公告一1 02008本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出和归口。本标准起草单位：中国农业大学动物医学院。本标准主要起草人：沈建忠、张素霞、丁双阳
2、、李建成、王战辉、江海洋、李晓薇。本标准系首次发布的国家标准。1范围农业部1025号公告一102008动物性食品中替米考星残留检测高效液相色谱法本标准规定了动物性食品中替米考星残留量测定的制样和高效液相色谱方法。本标准适用于猪肝脏、猪肌肉、鸡肝脏和鸡肌肉中替米考星残留的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样31
3、样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。32样品的保存20冰箱中贮存备用。4测定方法4 1方法原理或提要用乙腈和磷酸二氢钾缓冲液提取试样中的替米考星，加水稀释后，用C，s固相萃取柱净化，反相高效液相色谱紫外检测，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1替米考星对照品(Timicosin)纯度98。422乙腈4 2 3四氢呋喃42 4磷酸二氢钾4 2 5甲醇4 2 6二丁胺4 2 7磷酸428乙酸铵42 9 C，。固相萃取柱500 mg6cc。4 2 10微7L滤膜】农业部1025号公
4、告一1020084 2 11 10磷酸溶液取100 mL磷酸缓慢加入900 mL水中，边加边搅拌，用水稀释至l 000 mL。4212二丁胺磷酸缓冲液(1 toolL)取10磷酸溶液700 mL，缓缓加入168 mL二丁胺，边加边搅拌。冷却至室温，用85磷酸调pH至25，加水稀释至1 000 mL。注意溶液变成棕色时不能使用。4 2 13流动相(乙腈一四氢呋喃一1 toolL二丁胺磷酸缓冲液130+55+25，vvv)分别量取130mL乙腈、55mL四氢呋喃、25mL二丁胺磷酸缓冲液，依次加入700mL水中，用水稀释至1 000 mL，02“m滤膜过滤。配制前各组分要真空脱气，配制后不能再脱气
5、。使用时密封，以防止流动相中的有机溶剂挥发。4 2 14洗脱液(0 1 toolL乙酸铵甲醇一乙腈20+80，vV)称取771 g乙酸铵溶解于200 mL甲醇中，加790 mL乙腈混匀，冷却至室温，用乙腈稀释至1 000mL。4 2 15磷酸二氢钾缓冲液称取1361 g磷酸二氢钾溶解于800mL水中，用磷酸调pH至25，再用水稀释至1 000mL。4 2 16替米考星标准储备液(200 BgmL)称取替米考星对照品约20 mg于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容。4。C下避光保存，有效期3个月。4217替米考星标准储备液(20 pgniL)取200tgmL替米考星标准储备液1mL于10
6、mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容。4。C下避光保存，有效期3个月。4218标准工作溶液取适量20“gmL替米考星标准储备液于容量瓶中，用流动相稀释并定容，制成浓度为00519mL、01“mL、05 pgmL、5029mL、10019mL、250 f-gmL的系列标准工作溶液，现配现用。43仪器和设备4 3 1高效液相色谱仪配紫外检测器。432组织匀浆机433天平感量001 g。434分析天平感量0000 01 g。43 5离心机4 3 6振荡器437旋涡混合器4 3 8氮吹仪4 39固相萃取装置44试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。
7、2农业部1 025号公告一1 02008取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定步骤4 5 1提取称取509o05 g试样于50mL离心管中，加8mL乙腈，涡动混匀，中速振荡20min，3 500 rrain离心10 min，取上清液于100 mE离心管中，组织残渣中依次加5 mL磷酸二氢钾缓冲液和8 mL乙腈，搅动残渣，涡动混匀，中速振荡20 rain，3 500 rmin离心10 min，合并两次上清液，加40 mL水，3 500 rmin离心10 min，上清液转至另一离心管中，再加10 mL水混匀，为样品提取液。452净化将C，。固相萃取柱置于固相萃取装置
8、上，依次用10 mL甲醇和10 mL水平衡，将样品提取液过柱，自然流干，再依次用10 mL水和10 mL乙腈洗涤，抽真空干燥3 min，用25 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，30。C水浴中氮气吹干。加10 mL流动相溶解，涡动30 S，放置15 min，经微孔滤膜过滤，供高效液相色谱分析。固相萃取洗涤液和洗脱液流速均不超过1 mLrain。4 5 3测定4 5 3 1色谱条件色谱柱：C。柱，长250mm，内径46mm，粒径5”m，或相当者。柱温：30。流动相：乙腈四氢呋喃一1 molL二丁胺磷酸缓冲液(130+55+25，vvv)。流动相流速：10 mLmin。检测波长：290 rim。进样体积
9、：100“L。4 5 3 2液相色谱测定分别取适量试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中替米考星的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样液测定过程中应参插注入标准工作液，以便准确定量。标准品及试样液相色谱图见图A1、图A2和图A3。4 6结果计算和表述动物组织中替米考星的含量x，以质量分数微克每千克Q,gkg)表示，按式(1)计算：XCV(1) m式中：C试样液中对应的替米考星的浓度，单位为微克每毫升Q,gmL)；v溶解残留物所用流动相的体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留三位
10、有效数字。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法在猪肝、鸡肝中的检测限为25“gkg，定量限为50 sgkg。在猪肉、鸡肉中检测限为10“gkg，定量限为20 sgkg。5 2准确度本方法在005 sgg5 pgg添加浓度水平上猪肝、鸡肝空白添加回收率为60120。3农业部1 025号公告一1 02008本方法在002 pgg2”gg添加浓度水平上猪肉、鸡肉空白添加回收率为60120。5 3精密度本方法的批内变异系数15o，批间变异系数25o。1替米考星反式异构体色谱峰2替米考星顺式异构体色谱峰4mV 204mV 20附录A(资料性附录)色谱图、 丝一、0 5 10 15农业部1025号公告一10_2008图A 1 1斗gmL替米考星标准溶液色谱图Orain1替米考星反式异构体色谱峰2替米考星顺式异构体色谱峰图A 2空白肝脏样品色谱图4mV 201替米考星反式异构体色谱峰2替米考星顺式异构体色谱峰图A 3添加肝脏样品色谱图(o 2 pg】5
