1、ICS 67040x 00中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一262008动物源食品中氯霉素残留检测酶联免疫吸附法Determination of chloramphenicol in edible animal tissues by immunoassay20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 置农业部1025号公告一262008本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业大学、农业部兽药安全监督检验测试中心(北京)。本标准主要起草人：沈建忠、何方洋、史为民、万宇平、丁双阳、江海洋。1范围农业部1025号公告一262008动物源食品中
2、氯霉素残留检测酶联免疫吸附法本标准规定了检测动物源食品中氯霉素残留量的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本标准适用于动物源食品(猪、鸡肌肉和肝脏、鱼、虾、肠衣、牛奶和禽蛋样本)中氯霉素残留量的筛选检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 112001标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样31样品的制
3、备将组织样品解冻，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆；将肠衣干样本剪碎后均质，湿样本需用去离子水漂洗20 min，除去表面的盐分，沥干后置于组织匀浆机中高速匀浆；牛奶样本离心除去脂肪层；将鸡蛋样本打碎，用玻璃棒搅匀防止泡沫的产生。3 2样品的保存组织、肠衣样本在-20。C冰箱中贮存备用；牛奶和禽蛋样本在4 0C冰箱中贮存备用。4方法提要和原理基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。酶标板的微孔包被有偶联抗原，加入标准品或待测样品，再加入恩诺沙星单克隆抗体。包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，加入酶标记物，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加入底物液，使结合到板上的
4、酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450 nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中恩诺沙星浓度的自然对数成反比。5试剂和材料以下所有试剂，均为分析纯试剂水为符合GBT 6682规定的二级水。51乙酸乙酯。52乙腈。5 3正己烷。5 4亚硝基铁氰化钠Na。Fe(CN)sNO2Hz0。55硫酸锌(ZnSOt7H20)。56氯霉素酶联免疫试剂盒：28冰箱中保存。农业部1025号公告一2620085 6 1酶标板：8孔12条，包被有偶联抗原。5 6 2氯霉素系列标准溶液；0、005、o15、o45、135、405 ugL。5 63酶标记物。5 6 4氯霉素抗体(浓缩液)。56 5底物液(A、B液
5、)。5 6 6终止液。5 6 7洗涤液(浓缩液)。5 6 8缓冲液(浓缩液)。569缓冲液工作液将浓缩缓冲液(2倍浓缩)50mL用水稀释至100mL备用。5 7乙腈一水溶液量取无水乙腈84mL至玻璃瓶中，加人水16mL混合均匀。5 8 C液：0 36toolL亚硝基铁氰化钠缓冲液称取亚硝基铁氰化钠107 g，加水50 mL搅拌溶解，再加水定容至100 mL。5 9 D液：1 molL硫酸锌缓冲液称取硫酸锌288 g，加水60 mL搅拌溶解，再加水定容至100 mL。6仪器6 1酶标仪(配备450 nm滤光片)。6 2旋转蒸发仪。6 3匀浆器。64振荡器。65冷冻离心机。66微量移液器：单道20
6、止、50止、100 pI、1 000止；多道250 pL。6 7天平：感量001 g。68氮气吹干装置。7试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料；取制备后的空白样品，作为空白试料；取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。8样本提取81组织样本(肌肉、肝脏、鱼虾)称取试料(3001)g，置50 mL离心管中，加入乙酸乙酯6 mL振荡10 min，室温3 800 rrain以上离心10min。取出上层液4mL(约相当于2 g的样本)，50。cT刺-F，加入正己烷1mL溶解干燥的残留物，再加缓冲液工作液1 mL强烈振荡1 min，室温3 800 rmin以上离
7、一fl,15 rain，取50 pL用于分析。稀释倍数为05倍。注：在检测动物肝脏样品时，加入正己烷1 ml，溶解干燥的残留物，再加缓冲液工作液1“一后，只需振荡10 s(防止乳化现象产生)。农业部1025号公告一2620088 2肠衣样本称取试料(1O01)g，置50mL离心管中，加入乙酸乙酯10mL振荡10rain，室温3 800 rrain以上离心10 rain。取出上层液5 mL(相当于05 g的样本)，50。C下氮气吹干，加入正己烷1 mL溶解干燥的残留物，再加缓冲液工作液05mL强烈振荡1rain，室温3 800 rmin以上离心5rain，去上层相，取下层液50“L用于分析。稀释
8、倍数为1倍。8 3牛奶样本取试样5mL，置50mL离心管中，加入250 pL C液和250 pLD液彻底混合，4。C12。C 3 800 rrain以上离心10 min。如果没有冷冻离心机，请预先将样本冷却到8。C，转移出上层液22 mL(相当于2mL奶样)至一个新的离心管中，加入乙酸乙酯4 mL上下振荡10 min，室温3 800 rmin以上离心10rain，转移出乙酸乙酯2mL上层液体(相当于1mL奶样)，50。C下氮气吹干，用缓冲液工作液05mL溶解干燥的残留物，取50“L用于分析。稀释倍数为05倍。8 4禽蛋样本称取试样(3士o01)g，置50mL离心管中，加入乙腈水溶液9mL振荡1
9、0rain，15。C 3 800 rmin以上离心10 rain。取上层液3 mL，加入水3 mL和乙酸乙酯45 mL混合5 rain，15。C 3 800 frnin以上离心10 min，将上层有机相转移到试管中，50。C下氮气吹干，加入正己烷1 mL溶解残留物后，用缓冲液工作液2mL混合1min，15。C 3 800 rmin以上离心10min，去除JEC,烷，取50“I。用于分析。稀释倍数为2倍。9测定步骤9 1试剂的准备9 1 1洗涤液工作液将浓缩洗涤液40 mL(20倍浓缩)用水稀释至800 mL备用。91。2微孔板条将铝箔袋沿着外沿剪开，取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放
10、进原铝箔袋中，放人自封袋，保存于28。9 1 3氯霉素抗体工作液用缓冲液工作液按1：10的比例稀释氯霉素抗体浓缩液(如400 pL浓缩液+4 mL的缓冲液工作液，足够4个微孔板条32孔用)。9 2测定从4 6C冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20。C25。C)平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。9 2 1将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。9 22加入标准品或处理好的试样50“L到各自的微孔中，然后加入氯霉素抗体工作液50 pL到每个微L中。用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，室温环境中反应1 h。取出酶标板，将7L内液体甩干，
11、加入洗涤液工作液250HL到每个板孔中，洗板4次5次，用吸水纸拍干。9 23加入酶标记物100L到每个微孔中，盖板膜盖板，室温环境中反应30mln。取出酶标板，将孔内液体甩干，加人洗涤液工作液250”L到每个板孔中，洗板4次5次，用吸水纸拍干。92 4加入底物液A液50“L和底物液B液50 pL到微孔中，轻轻振荡混匀，室温环境中避光显色30min。9 25加入终止液50“L到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处，测定每iL吸光度值。926空白对照试验3农业部1 025号公告一262008完全按8和9的步骤进行操作。10结果计算101定性测定示例：以045“gi，标准液的吸光度值为判
12、定标准，样品吸光度值大于或等于该值为未检出，小于该值为可疑，建议用确证法确证。10 2定量测定按以下公式(1)计算百分吸光度值：相对吸光度值一孚looo un式中：B标准溶液或样品的平均吸光度值；B。o浓度的标准溶液平均吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应氯霉素(ngmL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，见公式(2)：X-m丛X丕1 000(2)式中：x试样中氯霉素的含量，单位为微克千克(或微克升)(”gkg或pgL)；A试样的相对吸光度值()对应的氯霉素的含量，单位为微克升(pgL)；，试样稀释倍数；m试样的取样量，单位为克或毫升(g或mL)。计算结果表示到小数点后两位。11检测方法灵敏度、准确度、精密度11 1灵敏度本方法在猪、鸡肌肉、肝脏、鱼、虾、牛奶样品中氯霉素的检出限为500 ngkgl在禽蛋和肠衣样品中氯霉素的检出限为1000 ngkg。本方法在样本中的定量限(LOQ)为025 p-gkg(L)。11 2准确度本方法的回收率为50110。11 3精密度本方法样本的变异系数小于20。
