1、ICS 67040X OO中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一162008动物尿液中盐酸克伦特罗残留检测气相色谱一质谱法The determination of clenbuterol in animal urineby GCMS method20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 菁农业部1025号公告一16-200B本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位：农业部畜禽产品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：单吉浩、薛毅、王海、吴银良、刘素英、刘勇军、侯东军、蔡英华、尤华。1范围农业部1025号公告一162008动
2、物尿液中盐酸克伦特罗残留检测气相色谱一质谱法本标准规定了动物尿液中盐酸克仑特罗残留量检测的制样和气相色谱一质谱的测定方法。本标准适用于猪尿中盐酸克仑特罗的残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新文本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本使用于本标准。GBT 11 2001标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则(ISOIEC Directives，Part3，1997，Rules for structur
3、e and drafting of International Standard，NEQ)GBT 6682 1992分析实验室用水规则和实验方法3制样31样品的制备取适量新鲜或冷冻尿液调节到室温，液体状态下使之均匀。32样品的保存-20以下冰箱中贮存备用。4测定方法4 1方法提要或原理调节样品的pH为52，用乙酸乙酯异丙醇提取，蒸干后用乙酸铵溶解，经固相萃取小柱净化，氮气吹干后经双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生，气相色谱一质谱仪测定。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合OBT6682规定的二级水。4 2 1盐酸克仑特罗含盐酸克仑特罗不得少于98。4 2
4、 2乙酸铵缓冲液(20mmoLL，pH 52)溶解I45 g乙酸铵于500mL700mL水中，用乙酸调整pH为52，稀释到1L。423 30mmoLL盐酸将27mL浓盐酸稀释到1L水中。4 2 4甲醇。425乙酸。42 6乙酸乙酯异丙醇提取液乙酸乙酯：异丙醇(6：4，体积比)混合。4 2 7氨水。428双三甲基硅基三氟乙酰胺(BsTFA)。429甲苯。4 210 4氨化甲醇用甲醇稀释4mL浓氨水至100mL。1农业部1 025号公告一1 620084 211 阳离子固相萃取小柱3 mL，500 mg。4 2 12盐酸克仑特罗标准储备液精确称取适量的盐酸克仑特罗标准品，用甲醇配成浓度约1 mgm
5、L的标准储备液，置2。C86C冰箱中保存，有效期3个月。42 13盐酸克仑特罗标准工作液准确量取适量盐酸克仑特罗标准储备液，用甲醇稀释成适宜浓度的盐酸克仑特罗标准工作液。4 3仪器和设备4 3 1电子天平：感量00001 g。4 3 2 50mL具塞离心瓶。43 3酸度计。43 4氮吹仪带水浴(或铝块)加热，配氮气瓶或氮气发生器。4 35固相萃取真空泵。43 6旋转蒸发仪。4 37离心机。4 3 8固相萃取装置。4 3 9旋涡混合器。4310恒温加热烘箱。4 3 11气相色谱仪(配质谱检测器)。4 4测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：一取供试样品离心后的上层溶液，作为供试材料。取空白
6、样品离心后的上层溶液，作为空白材料。一 取空白样品离心后的上层溶液，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 4 2提取准确移取尿样5omL于50mL具塞离心管中，用乙酸调pH至52，加入20mmoLL的乙酸铵缓冲溶液1 mL，混匀后再加入乙酸乙酯一异丙醇提取液10 mL，振荡混合2 rain，静置分层，用滴管收集上层有机相；下层溶液中加人乙酸乙酯异丙醇提取液10 mL，振荡混合2 rain，合并两次上层有机相溶液，80水浴中蒸干或50水浴旋转蒸发近干，加入20 mmoLL乙酸铵缓冲液2 mL，振荡溶解，作为备用液。44 3净化依次用甲醇5mL、水5mL和30retooLL盐酸5mL润洗固相
7、萃取小柱，将上述备用液过柱，依次用水5 mL、甲醇5 mL淋洗，真空抽干，用4氨化甲醇5 mL洗脱SCX小柱，收集洗脱液于具塞玻璃试管中，50。CqV氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1 mLrain左右。44 4衍生化及检测将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放人50烘箱中加热片刻，除去水分后，加入甲苯i00 ffL和双三甲基硅基删(BSTFA)i00pL，涡旋振荡20 s，密封玻璃塞，置于80恒温烘箱中加热1 h，冷却后加人300“L甲苯，作为试样溶液，供气相色谱一质谱分析。445标准曲线的制备分别准确量取5份空白尿液，按照样品处理过程，过完小柱并且氮气吹干后备用。取适量盐酸克仑特罗标准储
8、备液，用甲醇稀释成浓度分别为0005、001、005、010、050 ffgmL的标准工作液，分别准确吸取050 mL加到上述的备用空白样品中，涡旋振荡20 s，在50下弱氮气流吹干，按上述衍生化，农业部1025号公告一162008步骤进行，供气质联用色谱仪测定。446测定4 4 6 1色谱聂质谱参考条件色谱柱：HP一5MS 5苯基甲基聚硅氧烷，30mX025ram(内径)，025pm(膜厚)。进样口：220。进样方式：脉冲不分流。进样体积：1 pL。柱温：70。C(保持06min)，以25。Cmin升温至200。C(保持6rain)，以25。Cmin升温至280。C(保持5min)。载气：高
9、纯氦气(99999)，流速：09 mLrain。GCMS传输线温度：280。溶剂延迟：8 min。EM电压：高于调谐电压200 V。分析器温度：230。四极杆温度：106。选择离子监测：(MZ)86，243，262，277；定量离子：86。4 4 62测定法准确量取空白尿液，按照样品处理过程，过完小柱并且氮气吹干后备用。取适量试样溶液和相应的标准工作溶液加到上述的备用空白样品中，作单点或多点校准，以86碎片离子色谱峰(基峰)面积积分值定量。标准工作液及试样液中的盐酸克仑特罗响应值均应在仪器检测的线性范围之内。样品溶液的4个选择离子丰度若与标准溶液的4个选择离子丰度一致或在一定范围之内，可判断为
10、样品中含有盐酸克仑特罗；标准溶液和试样溶液的总离子色谱图(TIC)和选择离子色谱图(SIM)见附录A。4 4 7空白实验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。45结果计算和表述按下式(1)计算试料中盐酸克仑特罗的残留量(“gL)： x一糌式中：x试样中盐酸克仑特罗残留含量，gL；A样液中经衍生化盐酸克仑特罗86碎片离子的峰面积；A标准工作液中经衍生化盐酸克仑特罗86碎片离子的峰面积；e标准工作液中盐酸克仑特罗的浓度，,ugL；样液最终定容体积，mL；最初取样液体积，mL。注：计算结果扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留至小数点后2位。5检测方法灵敏度、准确度、精密度
11、5 1灵敏度本方法在猪尿中的检测定量限为1”gL。52准确度本方法在1 pgL10 ugL添加浓度的回收率为：60 oA110。农业部1025号公告一16200853精密度本方法的批内变异系数cV10，批间变异系数CV、15。附录A(资料性附录农业部1025号公告一1620081；l kJkTime一!JQQQJ5一图A 1盐酸克仑特罗标准溶液(100 IlgL】衍生化产物的总离子色谱图(TIC】8626224f 277150图A 2盐酸克仑特罗标准溶液(100腿L)衍生化产物的选择离子质谱图(SIM)ld3 000 lq9L，Lk h，101lq2 000一i 000一 一 A 】r。：=c=u jCK二ZTime-二”h图A 3盐酸克仑特罗标准溶液【100 l丑L)衍生化产物的4个选择离子色谱图农业部1025号公告一162008州 、以u、L一 N 9I图A4空白猪尿的总离子色谱图TIC)lon 8600(8570把86 70)：1104005D图A 5空白猪尿衍生化产物的4个选择离子色谱图图A 6空白猪尿中添加盐酸克仑特罗标准溶液【1肛gL)衍生化产物的总离子色谱图(TIC)农业部1025号公告一16200886243 262 277100 150图A 7空白猪尿中添加盐酸克仑特罗标准溶液(1嵋L)4个选择离子质谱图和色谱图
