1、ICS 67040x 00中华人民 共禾1口，、n 国国家标准农业部1025号公告一62008动物性食品中莱克多巴胺残留检测酶联免疫吸附法Determination of ractopamine residue in animal derived foodELISA method20080429发布 2008-0429实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部1025号公告一62008本标准由中华人民共和国农业部提出和归El。本标准起草单位：中国农业大学动物医学院。本标准主要起草人：沈建忠、丁双阳、何方洋、万宇平、冯才伟、史为民、王战辉。本标准系首次发布的国家标准。农业部1025号公告62008
2、动物性食品中莱克多巴胺残留检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了检测动物性食品中莱克多巴胺残留量的酶联免疫吸附测定法。本标准适用于猪肉、猪肝和猪尿液中莱克多巴胺残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样3 1样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。取新鲜或解冻的尿液，6 0
3、00 rrain离心5 rain，取清亮上清液。32样品的保存一20冰箱中贮存备用。4测定方法4 1方法原理或提要采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的莱克多巴胺药物与酶标板上的偶联抗原竞争莱克多巴胺抗体，加酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450nrn处测定吸光度，吸光值与莱克多巴胺残留量成负相关，与标准曲线比较即可得出莱克多巴胺残留含量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的二级水。4 21乙腈422正己烷423莱克多巴胺检测试剂盒2。C8保存。424包被有莱克多巴胺偶联抗原的96孔板规格为1
4、2条8孔。4 2 5莱克多巴胺抗体工作液42 6酶标记物工作液4 2 7 20倍浓缩洗涤液42 8 5倍浓缩缓冲液1农业部1025号公告一6-20084 2 9底物液A液4 2 10底物液B液4211终止液4 2 12莱克多巴胺系列标准溶液至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白。4 2 13缓冲工作液用水将5倍浓缩缓冲液按1：4体积比进行稀释(1份5倍浓缩缓冲液+4份水)，用于溶解干燥的残留物。2。C8保存，有效期1个月。4 2 14洗涤液工作液用水将20倍的浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤。28保存，有效期1个月。4 3仪器和设备43
5、1酶标仪配备450 nm滤光片。43 2匀浆器4 3 3微量振荡器4 34离心机4 3 5微量移液器单道20止，50 pL，100 pL，1 000 pL；多道250止。4 3 6天平感量001 g。4 3 7氮气吹干装置4 4试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定步骤4 5 1猪肌肉和猪肝脏样品的前处理称取试样3 g+003 g于50mL离心管中，加乙腈9mL，振荡10min，4 000 rmin离心10mira取上清液4mL于10mL离心管中，50。C水浴下氮气吹干
6、；加正己烷1mL，涡动30 s；再加缓冲工作液1mL，涡动1min，4 000 rmin离心5min，肌肉组织取下层液100“L与样本缓冲工作液100 pL混合；肝组织取下层液50 pL与样本缓冲工作液150 pL混合，各取50 pL分析。肌肉组织的稀释倍数为15倍，肝组织的稀释倍数为3倍。45 2猪尿液样品的前处理取试样50“L直接用于分析。猪尿液样品的稀释倍数为1倍。45 3测定使用前将试剂盒在室温(1925。C)下放置1 h2 h。4 5 3 1 按每个标准溶液和试样溶液至少两个平行计算，将所需数目的酶标板条插入板架中。4 5 3 2加标准品或样本50 nL孔后，每孔再加莱克多巴胺抗体工
7、作液50止，轻轻振荡混匀。用盖板膜盖板，置室温下反应30 min。2农业部1025号公告620084533倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，加250 HL洗涤液工作液至每个孔中，5 S再倒掉孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体。再加250L洗涤液工作液，重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。4 5 34加酶标记物100“L$L。用盖板膜盖板后置室温下反应30 min，取出重复洗板步骤。4 fi 35加底物液A液和B液各50“L孔，轻轻振荡混匀于室温下避光显色15 min30 rain。4 53 6加终止液50L孔，轻轻振荡混匀，置酶标仪
8、于450 nm波长处测量吸光度值。4 6结果判定和表述用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式(1)：D相对吸光度值()一芋100(1)D 0式中：B标准(试样)溶液的吸光度值；B。空白(浓度为0标准溶液)的吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应莱克多巴胺标准品浓度(口gL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。5检测方法灵敏度、准确度、精密度51灵敏度本方法在猪肉、猪肝、尿液样品中莱克多巴胺的检测限依次为15肛gkg(L)、14 pgkg(L)、11pgkg(L)。5 2准确度本方法在2 ugkg(L)10“gkg(L)添加浓度水平上的回收率均为60120。53精密度本方法的批内变异系数20，批间变异系数30。
