1、ICS 67040X 00中华人民 共禾口 国国家标准农业部1025号公告一252008动物源食品中恩诺沙星残留检测酶联免疫吸附法Determination of enrofloxacin in edible animal tissues by immunoassay20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部1025号公告一252008本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国农业大学、农业部兽药安全监督检验测试中心(北京)。本标准主要起草人：沈建忠、何方洋、万宇平、江海洋、冯才伟、史为民、张素霞。1范围农业部1025号公告一252008动
2、物源食品中恩诺沙星残留检测酶联免疫吸附法本标准规定了检测动物源食品中恩诺沙星残留量的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本标准适用于动物源食品(猪、鸡肌肉和肝脏、水产、蜂蜜)中恩诺沙星残留量的筛选检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 112001标准化工作导则第一部分：标准的结构和编写规则GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样3 1样品的制
3、备将组织样品解冻，剪碎置于组织匀浆机中高速匀浆；取新鲜的蜂蜜样本。3 2样品的保存组织样本在一20冰箱中贮存备用；蜂蜜样本在4。C冰箱中贮存备用。4方法提要和原理基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。酶标板的微孔包被有偶联抗原，加入标准品或待测样品，再加入恩诺沙星单克隆抗体和酶标记物。包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加入底物液，使结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450 nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中恩诺沙星浓度的自然对数成反比。5试剂和材料以下所有试剂，均为分析纯试剂；水为符合GBT 668
4、2规定的二级水。51乙腈。5 2二氯甲烷。5 3氢氧化钠。5 4正己烷。55磷酸氢二钠(Na2 HP0412H20)。5 6磷酸二氢钠(NaH2PO,2H20)。5 7恩诺沙星检测试剂盒：2 6C8冰箱中保存。5 7 1酶标板：8条12孔，包被有偶联抗原。5 7 2恩诺沙星系列标准溶液：o、05、15、45、135、405“gL。1农业部1025号公告2520085 7 3酶标记物5 7 4恩诺沙星抗体5 7 5底物液(A、B液)5 7，6终止液5 7 7洗涤液(浓缩液)57 8缓冲液(浓缩液)58缓冲液工作液将浓缩缓冲液(2倍浓缩)50 mL用水稀释至100 mL备用。59 0 1 tool
5、L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠04 g至容量瓶中，加水溶解并定容至100 ml。5 10乙腈-0 1 molL氢氧化钠溶液量取无水乙腈84 mL加入01 molL氢氧化钠溶液16 mL混合均匀。5”0 02toolLPB缓冲液(pH7 2)称取Na2HP0412H20 516 g、NaH2PO。2H20 087 g至容量瓶中，加水溶解并定容至1L。6仪器6 1酶标仪(配备450 nnl滤光片)。6 2匀浆器。6 3振荡器。6 4离心机。6 5微量移液器：单道20止200 pL、200 pL1 000止；多道250 pL。6 6天平：感量001 g。6 7氮气吹干装置。7试料的制备试料的制备包括：取
6、制备后的供试样品，作为供试试料；取制备后的空白样品，作为空白试料；取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。8样本提取8 1组织样本称试样(30+001)g，置50 mL离心管中，加入乙腈一o1 toolL NaOH溶液9 mL，充分混合10 min，3 800 rrain以上、15。C离心10 rain，取上清液3 mL，加入002 molL PB缓冲液3 mL，加入二氯甲烷8 mI。，充分混合10 min，3 800 rmin以上、15。C离心10 rain，去除上层液，取下层有机相4 mL至干燥容器中，50。C氮气吹干，用缓冲液工作液l mL溶解干燥的残留物，加入正己烷
7、1 mL混合2 min，3 800 rminl2J,上_、15。C离心5 min，轻吸掉上层和中间部分液体，取下层液50 pL用于分析。稀释倍数为2倍。82蜂蜜样本取1-+-_001 g试样，置50mL离心管中，加入002molLPB缓冲液2mL，振荡至蜂蜜全部溶解，加入二氯甲烷8mL，振荡5rain，3 800 rrain以上离心5min，轻吸掉上层液，取下层有机相至干燥容器中，2农业部1 025号公告一25200850C氮气吹干，用缓冲液T作液1 mI溶解干燥的残留物，再用缓冲液工作液将其按1：3比例稀释(1份溶解后的样本液+3份缓冲液T作液)，取50“L用于分析。稀释倍数为4倍。9测定步
8、骤91试剂的准备911洗涤液工作液将浓缩洗涤液40 mL(20倍浓缩)用水稀释至800 mL备用。91 2微孔板条将铝箔袋沿着外沿剪开，取出需用数量的微iL板及框架，将不用的微孔板放进原铝箔袋中，放人自封袋，保存于28。9 2测定从4冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20。C25。C)平衡30 rain以上，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。921将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。9 22加入标准品或处理好的试样50“L到各自的微孔中，然后加入酶标记物50 pL到每个微孔，再加入恩诺沙星抗体50“L到每个微孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，室
9、温环境反应1 h，取出酶标板，将孔内液体甩干，加入洗涤液工作液250“L到每个板孔中，洗板4次5次，用吸水纸拍干。9 2 3加入底物液A液50”L和底物液B液50“L到微孔中，轻轻振荡混匀，室温环境避光显色30rain。9 2 4加入终止液50“L到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nlTl处，测定每孔吸光度值。9 3空白对照试验完全按8和9的步骤进行操作。10结果判定和表述10 1定性测定示例：以45弘gL标准液的吸光度值为判定标准，样品吸光度值大于或等于该值为未检出，小于该值为可疑，建议用确证法确证。10 2定量测定按以下公式计算百分吸光度值，见公式(1)：相对吸光度值一芋100(
10、1)u0式中：B标准溶液或样品的平均吸光度值；B。o浓度的标准溶液平均吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应恩诺沙星(”gL)的自然对数做半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，见公式(2)： x一揣(2)式中：X试样中恩诺沙星的含量，单位为微克千克或微克升(t-gkg或”gL)；A试样的相对吸光度值()对应的恩诺沙星含量，单位为微克升(t,gL)；，试样稀释倍数；3农业部1025号公告一252008m试样的取样量，单位为克或毫升(g或mL)。计算结果表示到小数点后两位。11检测方法灵敏度、准确度、精密度11 1灵敏度本方法在猪、鸡肌肉中恩诺沙星的检出限为10 pgkg；在猪、鸡肝脏中恩诺沙星的检出限为10”gkg；在水产中恩诺沙星的检出限为1t 5 ug虹；在蜂蜜中恩诺沙星的检出限为20 pgkg。本方法在样本中的定量限(LOQ)为10o ugkg。11 2准确度本方法的回收率为50110。11 3精密度本方法的添加样本变异系数小于20。4
