1、ICS 67040x OO中华人民共和国国家标准农业部t025号公告一42008动物性食品中安定残留检测酶联免疫吸附法Determination of diazepam residues in animal derived foodELISA method20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布刖 舌农业部1025号公告一42008本标准有中华人民共和国农业部提出和归口。本标准起草单位：中国农业大学。本标准主要起草人：沈建忠、张素霞、何方洋、万字平、史为民、冯才伟。本标准系首次发布的国家标准。动物性食品中安定残留检测酶联免疫吸附法农业部1025号公告一420081范围
2、本标准规定了动物源食品中安定残留量的制样和酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于猪肌肉、猪肝脏和猪尿液中安定残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和实验方法3制样3 1样品的制备取新鲜或解冻的空白或供试动物组织，剪碎，置于组织匀浆机中高速匀浆。取新鲜或解冻的尿液，6 000 rmin离心5 rain，取清亮上清液。32样品
3、的保存20冰箱中贮存备用。4测定方法41方法原理或提要基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。酶标板的微孔包被有偶联抗原，加入标准品或待测样品，再加入安定单克隆抗体和酶标记物。包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加入底物液，使结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450 nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中安定浓度的自然对数成反比。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1氢氧化钠4 2 2正己烷4 2 3安定检测试剂盒2。C8冰箱中保存。4
4、 2 3 1包被有安定偶联抗原的96孔板(12条x8孔)4 2 3 2安定系列标准溶液0、01、02、04、08、16”gL。4233安定抗体工作液4 2 3 4酶标记物工作液1农业部1 025号公告一420084 23 5底物液A液4 2 3 6底物液B液4 2 3 7终止液423 8 2倍浓缩缓冲液4 2 3 9 20倍浓缩洗涤液4 2 4缓冲液工作液用水将2倍的浓缩缓冲液按1：1体积比进行稀释(1份2倍浓缩缓冲液+1份水)，用于溶解干燥的残留物。4保存，有效期1个月。425洗涤液工作液用水将20倍的浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水)，用于酶标板的洗涤。4
5、保存，有效期1个月。4 2 6 0 1toolL氢氧化钠溶液称取氢氧化钠04 g于容量瓶中，加水溶解并定容至100 mL。4 3仪器和设备4 3 1酶标仪配备450 rllTl滤光片。4 3 2匀质器4 3 3振荡器4 34离心机4 35微量移液器单道20肛I200肛L、200肛L1 000肛L、多道250肛L。4 3 6天平感量001 g。4 37氮气吹干装置4 4试料的制备试料的制备包括：取制备后的供试样品，作为供试试料。取制备后的空白样品，作为空白试料。取制备后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 5测定步骤4 5 1猪肉、猪肝试样的提取称(2o02)g试样于50mL离
6、心管中，加01toolL氢氧化钠溶液8mL，振荡5min，4 000 rmin离心10 rain，分取上清液1 mL于另一离心管中，加正己烷10 mL，振荡5 mln，4 000 rrain离心5 rain，取上层正己烷5 mL于50水浴下氮气吹干，取缓冲液工作液1 mL溶解残留物，取50止分析。4 5 2猪尿液试样的提取取1mL清亮尿样于50mL离心管中，加01molL氢氧化钠溶液4mL，振荡5rain，取1mL混合液于另一离心管中，加正己烷10mL，振荡5rain，4 000 rrain离心5rain，取上层正己烷相5mL，50水浴下氮气吹干，取缓冲液工作液1 mL溶解残留物，取50”L分
7、析。4 53测定453 1使用前将试剂盒于室温(19-25。C)下放置1 h2 h。4 5 32按每个标准溶液和试样溶液至少两个平行计算，将所需数目的酶标板条插入板架。2农业部1025号公告一420084 5 3 3加50止系列标准溶液和试样液于各自的微孔中，然后每个微孔加安定抗体工作液50 pL。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25。C条件下反应30 rain。4 5 3 4倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，加洗涤液工作液250“L至每个孔中，5 S再倒掉孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。再用洗涤液工作液250”L重复洗涤两遍以上(或用
8、洗板机洗涤)。4 5 3 5向每孔加酶标记物工作液100“I。，用盖板膜封住酶标板，室温下反应30 rain。4 5 3 6取出酶标板，重复洗板步骤。4 5 3 7每孔加底物液A液50 pL和底物液B液50 pL，轻轻振荡混匀，25下避光显色15min。4 5 3 8每孔加50L终止液，轻轻振荡混匀，置酶标仪中于450 nm处测量吸光度值。4 6结果判定与表述用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。见式(1)：乜相对吸光度值()一詈100(1) Do式中：B一为标准(试样)溶液的吸光度值；Bo空白(浓度为。标准溶液)的吸光度值。将计算的相对吸光度值()对应安定标准品浓度(pgL)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法在猪肌肉、猪肝脏和猪尿中安定的检出限均为15肛gkg(L)。52准确度本方法在2“gkg(L)10#gkg(L)的空白添加回收率范围为60120。53精密度本方法的批内变异系数15，批间变异系数20。
