1、 ICS 67.100.01 DB37 B 40 山东省地方标准 DB37/T 606 2006 牛奶中恩诺沙星和环丙沙星残留量的测定 高效液相色谱法 Determination of enrofloxacin&ciprofloxacin residue in bovine milk high performance liquid chromatography 200 - -发布 2006-07-01 实施 山东省质量技术监督 局发布 DB37/T 6062006 I 前言 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。 本标准起草单位：山东省畜产品质量检测中心。 本标准主要起草
2、人：高迎春、陈玲、冯修光、魏秀丽。 DB37/T 6062006 1 牛奶中恩诺沙星和环丙沙星残留量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了牛奶中恩诺沙星和环丙沙星残留量的高效液相色谱测定法。 本标准适用于牛奶中恩诺沙星和环丙沙星残留量的测定，最低检出限为20 g/Kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和
3、试验方法 3 原理 牛奶中的恩诺沙星/环丙沙星经磷酸盐缓冲液提取，再经C 18柱固相萃取后，用HPLC分离，荧光检测 器测定，激发波长280 nm；发射波长450 nm。 4 试剂与材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水符合 GB/T 6682 一级水的规定。 4.1 恩诺沙星和环丙沙星对照品：含量均不得少于 99.0 %。 4.2 乙腈（CH 3CN）：色谱纯。 4.3 甲醇（CH 3OH）：色谱纯。 4.4 三乙胺C 6H15N）。 4.5 氢氧化钠（NaOH）。 4.6 磷酸(H 3PO4)。 4.7 磷酸二氢钾(KH 2PO4)。 4.8 氢氧化钠溶液c【（NaOH）】5.0 moL
4、/L：称取氢氧化钠（4.5）20g（准确至 0.1g），用水溶解 并稀释至 100mL。 4.9 氢氧化钠溶液 c【（NaOH）】0.03 moL/L：量取 5.0 mol/L 氢氧化钠溶液（4.8）12 ml，加水 稀释至 2000ml。 4.10 磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾（4.7）6.8 g，加水使溶解并稀释至 500 ml，用 5.0 mol/L 氢氧 化钠溶液（4.8）调pH 至7.0。 4.11 HPLC 流动相： 4.11.1 0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液： 量取磷酸（4.6）3.4 ml，加水稀释至1000 ml,用三乙胺（4.4） 调 pH 至 2.4，过 0.45 m
5、 水系微孔滤膜备用。现用现配。 4.11.2 流动相：0.05 mol/L磷酸-三乙胺溶液（4.11.1）+ 乙腈（4.2）82+18， 混匀，脱气后备用。 4.12 恩诺沙星和环丙沙星标准储 备液：分别精密称取恩诺沙星/环丙沙星 对照品（4.1）各 10 mg（准确 至 0.01 mg），至同一 1000 mL 量瓶中，加 0.03 mol/L氢 氧化钠溶液（4.8）溶解并稀释至刻度，摇匀。 其浓度为 10g /mL。 4.13 恩诺沙星和环丙沙星标准中间液：精密量取恩诺沙星和环丙沙星标准储备液（4.12）1.00 mL，置 100 mL 量瓶中，用乙腈（4.2）稀释至刻度，摇匀。其浓度为
6、100 ng/mL。 4.14 恩诺沙星和环丙沙星标准工作液：精密量取恩 诺沙星和环丙沙星标 准中间液（4.13）1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00 ml、15. 00 mL、20.00 mL、50.00 mL于 100 ml 量瓶中，用流动相（4 .12）稀释成 DB37/T6062006 2 浓度分别1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml 的环丙沙星和恩诺沙星系列 标准工作液。现用现配。 5 仪器 5.1 高效液相色谱仪：具荧光检测器。 5.2 天平：感量0.01 g。 5.3 分析天平
7、：感量 0.0001。 5.4 振荡器。 5.5 匀浆机（10000 r/min）。 5.6 离心机（4000 r/min）。 5.7 真空泵。 5.8 C18萃取柱。 5.9 针头过滤器：孔径为 0.45 m 有机系滤膜。 5.10 离心管：50 ml。 6 分析步骤 6.1 C18柱前处理 取C 18柱，依次使用2 ml甲醇（4.3）和2ml水 润洗后备用。 6.2 提取 称取 5 g0.05 g供试试样，置30 ml匀浆杯中，加磷酸盐缓冲液（4.10）10. 0 ml，匀浆30 S，匀浆液 转入50 ml离心管（5.10）中，振荡5 min，离心10 min，上清液过C 18萃取柱（6.
8、1） 。用磷酸盐缓冲液（4.10） 10.0 ml冲洗刀头及匀浆杯，洗液合并入50 ml含残渣离心管中，搅匀，振荡5 min，离心10 min，上清液过同一 C18萃取柱。用2 ml水洗C 18萃取柱，挤干，精密加入2 ml流动相洗脱，挤干，收集洗脱液用 0.45 m有机系滤膜 （5.9）过滤，滤液待测。同时做试剂空白。 6.3 测定 6.3.1 高效液相色谱参考条件 色谱柱：C 18柱，250 mm4.6 mm，粒径5 m。 流动相：0.0 5 mol/L磷酸-三乙胺溶液（4.10）+ 乙腈（4.2）82+18。 柱温：室温。 流速：0.8 ml/min。 检测器：荧光检测器。 检测波长：激
9、发波长280 nm；发射波长450 nm。 进样量：20 L。 6.3.2 定量测定 调整仪器参数，向色谱柱中注入标准工作液（4.15） ，积分得到色谱峰面积，作标准曲线。同法测 定样品和空白溶液（6.2） ，用标准曲线定量。 7 结果计算 按照（1）式计算： （ Ci-Co） V1000 X i = （1） m 式中： Xi 试样中恩诺沙星和环丙沙星的含量，单位为微克每千克（g/Kg）； DB37/T 6062006 3 Ci供试样品溶液恩 诺沙星和环丙沙星的 浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；。 Co空白溶液恩诺沙星和环丙沙星的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）； m 试样的质量，单位为克(g)； V 供试试样固相萃取洗脱液总体积，单位为毫升（mL）； 以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。计算结果保留三位有效数字。 8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15 %。
