1、ICS 65.120 B 46 DB13 河北省地方标准 DB13/T 1384.72011 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺 氟沙星的测定 Determination of enrofloxacin/ciprofloxacin/norfloxacin in feed 2011 - 05 - 10 发布 2011 - 05 - 20 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 1384.72011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、河北省医科大学、北京出入境检验检疫局技术 中心、石
2、家庄市疾病预防控制中心、河北省饲料产品质量监督检验站。 本标准主要起草人：张岩、李挥、吕品、丛斌、卢小宇、张宏、范斌、贾茜、马春玲、米振杰、杨 立学、李志平、沈磊、高振同、武英利。 DB13/T 1384.72011 1 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定 1 范围 本标准规定了饲料中恩诺沙星，环丙沙星，诺氟沙星的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料中恩诺沙星，环丙沙星，诺氟沙星的测定。 本标准的方法检出限为10.0 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包
3、括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法（ GB/T 66822008， ISO 3696:1987,MOD）。 3 方法提要 试样加入内标后， 氢氧化钠溶液提取， 离子化的喹诺酮类药物经过阴离子交换固相萃取柱富集净化， 用液相色谱-质谱/质谱法测定，梯度洗脱，内标法定量。 4 试剂与材料 除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 甲醇： HPLC 级。 4.2 氢氧化钠。 4.3 甲酸（85）。 4.4 阴离子交换柱（ PAX）：60 mg，3 mL，或相当者。 4.5 同位素内标：氘代诺氟沙星，纯度98。 4
4、.6 恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准品：纯度99。 4.7 恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准储备溶液：1 mg/mL。准确称取适量的恩诺沙星、环丙沙星 和诺氟沙星标准品，甲醇配成 1.0 mg/mL 的标准储备液。储备液储备在 4冰箱中，可保存 6 个月。 4.8 恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星标准工作溶液：用甲醇水（28，体积比）分别配成浓度范围 为1 ng/mL60 ng/mL 标准工作溶液，其中内标溶液浓度为 50 ng/mL，现配。 4.9 氘代诺氟沙星（ NOR D 5 ） 内标储备溶液：100 g/mL。称取适量的 NOR D 5 内标物（4.5）， 用甲醇（4.1）配成 100
5、g/mL 储备液，储备液储存在 4冰箱中。 4.10 氘代诺氟沙星（ NOR D 5 ） 内标储备溶液：1 g/mL。取适量的内标储备液（4.8），用甲醇 （4.1）稀释成 100 g/mL 储备液，内标工作溶液在 4下保存。 4.11 氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：取 4 g 氢氧化钠，溶解于 1 L 水中。 4.12 甲酸-甲醇溶液（595，体积比）：取 5 mL 甲酸（4.3）于 80 mL 水中，混合均匀。 DB13/T 1384.72011 2 5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾粒子源。 5.2 分析天平：感量 0.001 g，0.1 mg，各一台。 5.3
6、 旋转蒸发仪。 5.4 固相萃取装置。 5.5 涡旋均混器。 5.6 真空泵：真空度不低于 80 kPa。 5.7 滤膜：有机系，0.45 m。 5.8 离心管：100 mL，具塞。 6 试样的制备 6.1 提取 准确称取 5 g 样品（精确至 0.01 g） ，置于 100 mL 离心管中，加经灼烧的无水硫酸钠，用干净玻 璃棒将样品与无水硫酸钠搅拌分散均匀，准确加入 1 g/mL 内标溶液 50 L，加入 20 mL 氢氧化钠溶 液，于涡旋均匀器上快速混匀。以 5 000 r/min 的速度离心 5 min，上清液移入 125 mL 分液漏斗中，加 20 mL 正己烷混合，涡漩振荡，静置分层
7、，取下层水相待净化。 6.2 净化 依次用 3 mL 甲醇和 3 mL 水活化固相萃取柱，将样品溶液转移到小柱上，依次用水、甲醇淋洗， 弃去上述滤液。用甲酸 -甲醇溶液 3 mL 洗脱。40水浴旋转蒸发至干，用甲醇-水定容 1.0 mL,过 0.45 m 的滤膜到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。 7 测定步骤 7.1 测定 7.1.1 参考液相色谱条件 色谱柱： C 18 ，3 m，150 mm2.0 mm(内径 )或相当者。 流动相：甲醇（ A） +0.1%甲酸水溶液（ B） 。 流速：0.20 mL/min。 梯度洗脱程序：参见表 1。 柱温：室温。 进样量：25 L。 DB13/T 1
8、384.72011 3 表1 梯度洗脱程序 7.1.2 参考质谱条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测。 电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。 定性离子对、定量离子对见表 2。 表2 定性离子对、定量离子对 恩诺沙星 环丙沙星 诺氟沙星 氘代诺氟沙星 定性离子对（ m/z） 360/316 360/245 332/231 332/288 320/276 320/302 325/281 定量离子对（ m/ z） 360/316 332/231 320/276 325/281 7.2 定性定量 7.2.1 定性测定 进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时
9、间和标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图 中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液质谱图相比，最大允许相对偏差不 超过表 3 中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许相对偏差 相对离子丰度 50 2050 1020 10 允许的相对偏差 20 25 30 50 7.2.2 定量测定 标准工作溶液在液相色谱 -串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标， 工作溶液浓度（ ng/mL）为横坐标，绘制标准工作曲线（1 ng/mL60 ng/mL ） ，用标准工作曲线对样品 进行定量，样品溶液响应值均在仪器测定的线
10、性范围内。在上述色谱条件下，其相应的标准物质和内标 离子流色谱图参见附录 A。 7.3 空白实验 除不加入试样外，按上述（7.17.3）步骤进行。 时间（ min） A（） B（） 0 10 90 2.00 10 90 4.00 90 10 8.00 90 10 9.00 10 90 15.00 10 90 DB13/T 1384.72011 4 8 结果计算 结果按式（1）计算： MA mA C S S X X = .(1) 式中 : C X 一一样品中喹诺酮的浓度，单位为微克每千克（ g/kg） 。 A X 一一样品中喹诺酮的封面积与相应内标峰面积比值。 As标准品中喹诺酮的峰面积与相应内标峰面积比值。 ms 一一喹诺酮的质量，单位为纳克（ g） 。 m 一一溶解残余物所得试样溶液体积，单位为毫升（ mL） 。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15。 DB13/T 1384.72011 5 A A 附 录 A （资料性附录） MRM 色谱图 图A.1 恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的 MRM 色谱图 _
