1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部958号公告一82007牛可食性组织中克仑特罗残留检测方法气相色谱一质谱法Gas chromatographic mass spectrum method for the determination ofclenbuterol residues in edible tissues of cattle20071229发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 舌农业部958号公告一82007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准由华中农业大学负责起草。本标准主要起草人：袁宗辉、陶燕飞、王玉莲、陈冬
2、梅、黄玲利、范盛先、彭大鹏、刘振利、戴梦红。本标准系首次发布的农业标准。1范围农业部958号公告一82007牛可食性组织中克仑特罗残留检测方法气相色谱一质谱法本标准规定了牛可食性组织中克仑特罗残留量检测的制样和气相色谱质谱检测方法。本标准适用于牛的肌肉、肝脏、肾脏中克仑特罗残留量的定量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 112000标准化工作导则 第
3、1部分：标准的结构和编写规则(ISOIEC Directives，Part 3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)GBT 6682-1992分析实验室用水规则和试验方法农业部农牧发E20031号兽药残留试验技术规范(试行)3制样3 1样品的制备取新鲜或冷冻空白、供试组织，去除筋膜，绞碎，5 000 rrain均质5 min。3 2样品的保存20以下贮存。4测定方法41方法提要或原理对样品在碱化的条件下用乙酸乙酯提取，利用溶于酸性溶液的特点，稀盐酸反萃取，SCX净化，经过双三甲基硅基；
4、i氟乙酰胺(BSTFA)衍生后用气相色谱质谱联用仪测定。4 2试剂和材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯；水为符合GBT 6682规定的二级水。4 21盐酸克仑特罗标准品：含量999，SIGMA公司。4 2 2 p一葡萄苷酸酶一芳基磺酸酯酶活性：每毫升不少于131 000 U 0葡萄苷酸酶和318 U芳基磺酸酯酶。4 2。3甲醇：分析纯。4 24乙酸乙酯：分析纯。4 2 5甲苯：分析纯。4 26无水碳酸钠：分析纯。427双三甲基硅基三氟乙酰胺，BSTFA。4 28 1moiL盐酸量取浓盐酸83 mI。，缓慢加入500 mL水中并搅拌，冷却后加水稀释至1 000 mL，混匀。1农业部958
5、号公告一820074 2 9 0 1 tooLL盐酸量取1 toolL盐酸10 mL，加水稀释至100 mL，混匀。42 10 0 03moLL盐酸量取1 toolI。盐酸30 mL，加水稀释至1 000 mI。，混匀。4211 4氨化甲醇(amonium methan01)取氨溶液4 mL(比重088 gmL)加水至100 ml。42。12 2 5tooLL氢氧化钠称取氢氧化钠10 g，加水溶解并稀释到100 ml。4 213 SCX小柱supelclean，LC SCX Sep Pak小柱500 mg3 mL。42，14盐酸克仑特罗标准储备液准确称取适量的盐酸克仑特罗标准品，用甲醇配成浓度
6、约l mgmL的标准储备液，一20。C以下贮存。4215盐酸克仑特罗标准工作液取贮备液用甲醇倍比稀释成5肛gL、10 pgL、20 pgI。、40肛gL、80 pgI作为标准工作液，4保存。4 3仪器及设备431分析天平：感量0000 01 g。432匀浆机。4 3 3旋涡混合器。43 4恒温箱，精度为2。4 3 5冷冻高速离心机。4，36 C-C-MS联用仪。4 4测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：一一取均质后的供试样品，作为供试试料。取均质后的空白样品，作为空白试料。442提取称取试料10 g士o05 g置于具塞聚四氟乙烯离心管中，加乙酸乙酯15 mL，加B一葡萄苷酸酶芳基磺酸酯
7、酶20 nL，再加10O碳酸钠溶液3 mI。，旋涡混匀，5 000 rmin离心10 rain，取上层有机溶剂于离心管中，再加乙酸乙酯10 m1。，旋涡混合，同前操作后合并提取液，加010 moI，L盐酸溶液5 mL，旋涡混合，以5 000 rmin的速度离心2 min，吸取下层溶液；同样步骤重复萃取一次，合并两次萃取液，用25 moLL氢氧化钠溶液调节pH至52。4 43净化SCX小柱依次用甲醇5mI，、水5mL和003mmoLL盐酸5mL活化，将442中萃取液上样至固相萃取小柱中，依次用水5mL和甲醇5mL淋洗柱子，在溶剂流过固相萃取柱后，抽干，用4氨化甲醇溶液3m1洗脱。4 44衍生化将
8、上述洗脱液50水浴氮气吹干，加甲苯100 pL和BSTFA i00 pI。，加盖旋涡混合，80。c加热衍生1 h(盖住盖子)，室温冷却后进行气相色谱一质谱分析。2农业部958号公告一8200744 5标准曲线的制备取标准工作液各浓度1 mL置于5 mL离心管中，加4氨化甲醇溶液2 mL，50。C水浴氮气吹干。加甲苯100”L和衍生化试剂100 tLL，旋涡混合，80。C2热衍生1 h，室温冷却后加进行气相色谱一质谱分析。每个浓度重复3次，将每批测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线，拟合，求回归方程和相关系数。44 6测定4 4 6 1 GCMS测定参数设定色谱柱：HP一5MS 5苯基甲基聚硅氧
9、烷，30mX025mm(内径)，025tin(膜厚)。进样口：220。进样方式：不分流进样。进样体积：2“L。柱温：120(omin)坚：!骂200(5min)坠：!坚290(84min)。载气：氦气，09 mLrain(恒流)。EI源：70eV。溶剂延迟：8 min。GCMS传输线温度：280。选择离子监测：(Mz)86，212，262，277。4 462质谱测定取试样溶液和相应的标准溶液做单点或多点校准，按外标法，以峰面积定量，即得。克仑特罗标准溶液和试样溶液的液相色谱图见附录A。45空白试验除不添加标准品工作液外，采用完全相同的步骤进行平行操作。4 6结果计算和表述试料中克仑特罗的残留量
10、(”gkg)，按式(1)计算： x一譬掣(1)A5m式中：X试料中克仑特罗残留量，“gkg；A一一试样溶液中克仑特罗衍生物的峰面积；As标准工作液中克仑特罗衍生物的峰面积；G上样时标准工作液中克仑特罗衍生物的质量浓度，pgL；v溶解残余物所得试样溶液体积，mL；m 一组织样品的质量，g。5检验方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度克仑特罗在牛的肌肉、肝脏和肾脏组织中的检测限为05 pgkg，定量限为1 pgkg。52准确度本方法在牛的肌肉、肝脏和肾脏中添加05 pgkg2 pgkg浓度的回收率为60120。5 3精密度本方法的批内、批间变异系数30。农业部958号公告82007Counts15
11、0125100755025附录A善h丌rml丌T耶T叮rr丌丌-叩丌-_T_雨下m仃下_r-卅下忡丌-下可叩 ol 816准5ppbs ll。25000 RIGll07BC乳i。置。池血监“盈100 150图A 1 克仑特罗标准液衍生物(5峨L)选择离子流图及质谱图。一 9 00 9 25 9 50 9 75 10 00250儿9611minScan562ChatdIo“2500usPdC：829BC26210 25 100 150 200图A 2牛肝脏空白添加0 5 pgkg盐酸克仑特罗选择离子流图及质谱图c。tlllt8 j 锰Ion删s：86+212，+。2。62。+277棚_15。 j
12、125 。00 i s 4 js0 4 ；zsr一小，、W。h_M人卜rrrl，rn，rn，T”TTrrnlT，rr，trn，rn可BP86(55=100)肌肉 9 527minScanChan：l86添加o 5s脚 24821RIC：822BC| 1I ：。： js1651 811s。：，243型“m“山心“山山删U山9 25 9 50 9 75 1000 minutes 100 150 200 250 ndz图A 3牛肌肉空白添加0 5 llgkg盐酸克仑特罗选择离子流图及克仑特罗质谱图肉邮。一哪吣|耋釉ll篙撕；秭帆咣嘲砉萋嘶农业部958号公告一82007图A 4牛肾脏空白添加0 5肛gkg盐酸克仑特罗选择离子流图及质谱图一够业|。，LT掘k4llii1，h：_*2一呷h”上n2一rd2L1w山一j，拍11i山一扛瑚c星姗，：鹤阡m蛳一笛m，n，啦一， 一寥一K；坠基
