1、GB/T 19267.3-2003 22 前言GB/T 19267(刑事技术微量物证的理化检验分为12个部分g第1部分=红外吸收光谱法，第2部分2紫外-可见吸收光谱法s第3部分g分子荧光光谱法p第4部分z原子发射光谱法p一一第5部分z原子吸收光谱法;一一第6部分:扫描电子显微镜法;第7部分E气相色谱-质谱法;第8部分2显微分光光度法，第9部分:薄层色谱法;第10部分g气相色谱法;第11部分高效液相色谱法;第12部分.热分析法。本部分为GB/T19267第3部分。本部分由全国刑事技术标准化技术委员会(CSBTS/TC179)提出并归口。本部分的起草单位:中国刑事警察学院。本部分起草人z王彦吉。G
2、B/T 19267.3-2003 1 范围刑事技术微量物证的理化检验第3部分:分子荧光光谱法本部分规定了分子荧光光谱的检验方法。本部分适用于刑事技术领域中微量物证的理化检验，其他领域亦可参照使用。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T19267的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 13966-1992 分析仪器术语GB/T 19267.2-2003 刑事技术微量物证的理化检验第2部
3、分:紫外可见吸收光谱法3 术语和定义GB/T 13966中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。3.1 荧光fluorescence 一个原子、分子或离子吸收一个光子接着又转变为总自旋量子数不变的基态时发生的电磁辐射。此电磁辐射的延续时间(余辉时间)与温度无关，一般小于10-8S。3.2 3.3 3.4 荧光光谱fluorescence spectrum 包括荧光发射光谱和荧光激发光谱a) 荧光发射光谱在固定激发波长条件下，荧光强度随发射波长变化的分布曲线。b) 荧光激发光谱=在固定发射波长条件下，荧光强度随激发波长变化的分布曲线。荧光光谱法f1 uorospectrometry 根据获得的荧
4、光激发光谱、发射光谱等参数对物质进行定性、定量和结构分析的方法。同步扫描光谱synchro - scan s肘ctrum是指在荧光物质的测定中，选择适当的激发光谱和发射光谱的波长差(通常选用与.m之差)，同时扫描激发波长和发射波长所得的光谱。3.5 3.6 三维荧光光谱three - dimensional fluorescence spectrum 描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱。时间分辨荧光光谱time resolution fluorescence sp配trum同时固定激发光和发射光波长的条件下，荧光强度随时间变化的曲线。23 GB/19267.3-2003 3.7
5、 荧光强度f1uorescent intensity 指荧光的相对强度，单位是任意的。物质的相对荧光强度与仪器性能、入射光强度、溶液浓度及该物质的量子产率等因素有关。可用下式表示z3.8 3.9 式中:I一荧光强度;f一一量子产率;1，-激发光强度gb 光路长度;c 溶液浓度;荧光强度1= K, I,(l-e-b,) 摩尔吸光系数，与激发光波长相对应gk一一常数。峰位peak position 激发峰和发射峰的波长所在位置，分别用儿、m表示谱带宽度sp四tra.bandwidth 在检测辐射功率峰值的二分之一处，从单色器出口狭缝射出的辐射能量的波长区间。3.10 荧光寿命fluorescenc
6、e lifetime 停止激发后，荧光强度降到激发时最大荧光强度的1/e所用时间，用表示。3.11 荧光猝灭fluorescence quenching 处于激发态的分子，通过内部能量转移或碰撞失去能量，国到基态的过程。3.12 斯托克斯位移Stock四shift荧光的发射波长大于激发波长，发射峰位和激发峰位的波长差称为斯托克斯位移。3.13 荧光效率fl uorescence yield 荧光效率也称量子产率，用也表示，等于发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比值。3.14 瑞利散射ray.eigh sca!tering 激发光的光子与作为散射中心的分子相互作用时，光子发生方向改变形成散射
7、，散射光的频率与激发光的频率相同。3.15 拉曼散射Raman scattering 激发光的光子与作为散射中心的分子相互作用时发生能量交换，分子吸收了频率较低的激发光，上升到基态中较高的振动能级，再返回到稍高或稍低于原来的能级，形成不同于激发光频率的散射。4 原理分子吸收紫外或可见光后，基态分子跃迁到各个不同振动能层的单线态电子激发态，再经振动驰豫和(或)内转换衰变到第一电子激发态的最低振动能级，然后再跃迁到基态的各个不同振动能级，并发射24 GB/T 19267.3-2003 相应的光量子。由于物质分子结构不同，所以吸收光及发射荧光的波长和强度不同，即不同物质具有不同的荧光激发光谱和发射光
8、谱，而且对于同一物质，浓度不同，荧光强度也不同，从而可用来进行定性和定量分析。5 仪器5.1 仪器名称荧光分光光度计。5.2 仪器组成5.2.1 激发光源常用的光源是ili灯及高压佩灯。其中，高压佩弧灯是目前荧光分光光度汁中应用最广泛的一种光源，属短弧气体放电灯，在250nm800 nm光谱区呈连续光谱，外套为石英，内充佩气，室温时压力为5标准大气压，工作时压力约为20标准大气压。5.2.2 单色器是一种能把复合光分解为单色光并能从中选出所需波长的装置。荧光分光光度计有两个单色器，即激发单色器和发射单色器。光栅是单色器的主要色散元件，另外单色器还含有狭缝、透镜和反射镜系统。5.2.3 吸收池石
9、英元荧光池，四面透明。5.2.4 检测器接收光信号，并将其转变为电信号的装置，目前应用较多的是光电倍增管。5.2.5 记录仪大部分采用自动记录仪，并可配有数据处理系统。5.3 校正与调试5.3.1 波长校正5.3. 1. 1 发射单色器校正把一个乘灯放在样品室中，点燃，选择狭缝为2nm(若谱线强度弱，可以增大狭缝)。调节光栅和光路准直系统，直至仪器输出的13条谱线的波长与表l中的标准值一致。也可将发射单色器固定在表l中13条谱线中的任一波长，调节单色器使发射出的荧光强度最大。5.3.1.2 激发单色器校正把录灯放在激发光源的位置，将发射单色器的波长调至零，在样品室中放一块漫散射板或高散射的溶液
10、，根据表I中13条主要谱线校正激发单色器波长。5.3. 1. 3 波长校正的精度应在紫外及可见光区分别选择波长进行校正。13条求线可以全选，也可选几条，也可以选一条。选择的波长点越多，则在整个工作范围内的波长精度越高。实际检验中经常采用加校正值的方法，即在误差不大的情况下，将表l中13条录线的真值与实际测量值之差作为修正波长的校正值。5.3.2 发射光谱和激发光谱的校正5.3.2.1 光量子计一微机校正法表1亲灯的主要辉线波长把盛罗丹明B乙醇溶液(3g/U的石英三角柱池光量子计放入样品室，在发射单色器的人口处插入一红色滤光片以滤去杂散光，保证仅让630nm荧光(罗丹明日的:)通过.把单色器的发
11、射波长设25 GB/T 19267.3-2003 置在630nm，扫描激发单色楞，检测到的信号存入微机并进行1日一化处理g经微机处理后的输出信号，即激发光强与波长的关系，应为恒定的值，此时绘制的激发光谱，即为经过样品校正的激发光谱。5.3.2.2 微机一散射光法把散射光板插入样品室，在波长差为零的条件下作同步扫描荧光强度。在无波长误差的情况下，激发光谱和发射光谱应完全重合。若存在发射单色器的波长误差，利用微机使之校正到一致，并作归一化处理，输出信号应为恒定的值。5.3.3 灵敏度校正常用来进行灵敏度校正的标准荧光物质有:10-2 mol/L- lO- mol/L盼一甲醇、10-2mol/L-1
12、0- mol/L呵|味乙醇、O.1 mol/L-O. 3 mol/L喳琳硫酸(0.05mol/L)、荧光素水(或乙醇)、2氨基收院硫酸等。10-5mol/L的2氨基咣睫硫酸溶液(0.05mol/L)常作为300nm-400 nm范围的标准溶液，有关数据见表20表210-5 moI/L的2-氨基毗睫-硫酸溶液荧光波长及相对强度/nm r% /nm r% ./nm 1% 320 2.5 368 100.0 410 37.0 330 9.5 370 99.5 420 26.5 340 33.0 380 91. 8 430 17.5 350 66.5 390 26.0 440 10.8 360 94.
13、0 400 53.5 450 7.5 5.4 性能指标5.4.1 波长准确度仪器显示的波长与激发单色器和发射单色器单色光的实际波长值之间的差值均应小于等于2.0nm。5.4.2 光度重现性相同条件下重复测得的荧光强度的变动性小于等于2.5%。5.4.3 倍曝比蒸馆水的拉曼峰强度值S与噪音N的关系应符合S/N大于等于25。6 样晶制备6.1 试样待测试样的荧光光谱测定须在透明溶液中进行。应选用合适的溶剂溶解待测样品为浓度适宜的溶液，选择溶剂的原则是:a) 溶剂本身无荧光;b) 溶剂不与被测物质发生化学反应pc) 对试样有良好的溶解能力;d) 被测组分在溶剂中具有良好的峰形;e) 溶剂的极性要尽量
14、小。6.2 比对样晶将比对样品用相同溶剂溶解成与待测样品浓度相近的溶液，待测。6.3 实例6.3.1 纺织纤维上染料选取若干相同长度的单根纤维，分别加入相同体积的不同溶剂，必要时可适当加热。比较各类溶剂对染料的提取能力，同时用体视显微镜观察纤维形态的变化以确定提取溶剂是否合适，要求萃取剂仅能溶涨而不溶解和分解纤维。提取时应视检材的多少采用不同方法。如单根纤维达1cm长度，采用微量26 GB!T 19267.3-2003 提取器进行提取(见GB/T19267.2-2003的6.2.3)。检材量较多，也可以直接在具塞试管中提取、测定。大多数纤维上染料只需数分钟即可提取完全。6.3.2 油脂选取合适
15、的溶剂将附着在不同载体上的油脂溶解下来。为避免载体组分被溶解，不要长时间浸泡检材。若提取液含水分、颜色深、或有泥浆等固体杂质，可分别用无水硫酸纳脱水、活性炭脱色、玻璃纤维过滤等方法处理。7 试验方法7.1 清除光路中可能遗留的干扰物，打开主机。7.2 试验条件选择7.2.1 波长定量分析应选择最强发射峰的波长(:)为测量波长。当共存杂质干扰、待测组分浓度过大或吸收峰太尖锐，应选用灵敏度稍低、不受干扰的次强峰的波长为测量波长。7.2.2 波长范围定性分析时对已知光谱特征的样品，不需进行大范围扫捕。测试未知光i普特征的样品，激发光谱和发射光谱的扫描范围应宽一些。如扫描发射光谱时应在短波方向多扫描一
16、段，以观察瑞利散射和拉曼散射的影响。7.2.3 狭缝一般定性测定狭缝宽度可设定为1nm,._ 5 nm，定量测定狭缝宽度设定为5nm,._.10 nmo测发射光谱时，激发狭缝可设为5nm,-., 10 nm，甚至15nm，而发射狭缝设定为2nm,-._, 5 nm。7.2.4 横、纵坐标的范围横坐标的刻度一般选择为(1cm5 cm)!100 nm，纵坐标的选择要兼顾荧光强度和噪声，一般在2以下。如果数据累加降低噪声，纵坐标还可以放大.7.2.5 选择扫描速度7.3 测定检测试样或比对样品溶液，绘制谱图。7.4 定性分析7.4.1 光谱特征测定测定试样的荧光光谱，获得发射峰的数目、位置、强度以及
17、激发光谱和发射光谱的形状(极大、极小值和拐点)等光谱特征，并与比对样品的谱图或标准谱图作比较。7.4.2 比对实验同时比较试样和比对样品的激发光谱和发射光谱每个峰的峰位、峰的数目、形状以及各峰之间的相对强度，只有完全相同时才有可能为同一物质。如果是单峰的话，试样和比对样品需在相同的浓度条件下进行比较。7.4.3 联合试验将荧光光谱法与其他光谱方法配合使用，可用于检测含有共辄链、芳环等官能团的化合物。7.5 定量分析7.5.1 标准对照法用于单组分测定。在相同条件下配制比对样品和试样溶液，分别测定荧光强度。用下式计算=C财Xl锺队L样晶=-，一-且比对式中(w 待测物的浓度;27 GBjT 19
18、267.3-2003 I比对比对样品荧光强度;I. 样品荧光强度;C比对比对溶液浓度。7.5.2 标准曲线法和回归直线法7.5.2.1 标准曲线法配制一系列浓度不同的标准溶液，在相同实验条件下，测定荧光强度，然后以标准溶液的浓度为横坐标，以相应的荧光强度为纵坐标，绘制关系图，在符合Beer定律时，可获得一直线。在工作曲线的条件下测出样品溶液的荧光强度，从标准曲线上查出样品的浓度。7.5.2.2 回归直线法用回归直线方程计算样品的浓度式中zI 某波长下的荧光强度;C 待测组分浓度;a 校准曲线截距;b一一校准曲线斜率。7.5.3 导敢光谱法式中IbC+ dI OCL dA dI 画n阶导数，以振幅值表示，n可取1.2，3，4;C 样品浓度。在导数光谱中以振幅(dIjd)与相应的浓度作图，在符合Beer定律时，可获一直线。按照线性范围的关系，求得待测物浓度。分析结果要求相对标准偏差小于1%。B 结果表述检材或试样的谱图与比对样品的谱图(或标准谱图)在相同实验条件下进行定性比较或定量测定后，应给出检材与比对样品是否相同或含量范围的结论。28
