1、ICS 67.050 X 04 中华人民共本日国国家标准GB/T 20746-2006 牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、瞌乙醇及代谢物残留量的测定液相色i普皿串联质谱法Method for the determination of the residues of carbadox, olaquindox and related metabolites in bovine and porcine liver and muscIe tissues一LC-MS-MS method 2006-12-31发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2007-03-01实施发布中华人民共和
2、国国家梅准牛、猪肝脏和肌肉中卡曰氧、睡乙醇及代谢物残留量的测定班相色谱串联质谱法GB!T 20746-2006 怜中国标准出版社出版发行北京复兴门外三盟问北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数17千字2007年3月第一版2007年3月第一次印刷9号书号:155066. 1-28932 定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533目U本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国秦皇岛出入境
3、检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。GB/T 20746-2006 本标准起草单位t中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:庞国芳、谢丽琪、欧阳姗、蓝芳、林黎、涂小坷。本标准系首次发布的国家标准。GB/T 20746-2006 牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、瞌乙醇及代谢物残留量的测定1 范围3-甲基喳H恶琳-2-捷酸残留量本标准适用于牛、猪仔甲基喳嗨琳-2-竣酸残F本标准的方法节制2 规范性引用文下列文件中I!I的修改单(不包#是否可使用这CGB/T 6379.1 GB/T 63 性与再现性的百GB/T 6 3 原
4、理用乙腊+乙至干，残渣用甲酸用甲酸榕准1肖过OasisMAX固相洗脱喳P恶琳-2-搜酸和3-液供准相色i普串联质谱仪4 试剂和材料夜相色谱-串联质谱法巴氧、喳曙琳-2-搜酸和嗤乙醇代谢物吗啕地问阿皿酬耐树倒V口恶琳-2-接酸和哇乙醇代谢物用文件，其随后所有成协议的各方研究准。准测量方法重复:1987) 皖脱脂后，旋转蒸发肝测定，内标法定量。盐酸酸化，离心过洁、后，用2%甲酸乙酸乙醋搭液除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4. 1 甲醇:色谱纯。4.2 乙腊t色谱纯。4.3 甲酸:色谱纯。4.4 正己蝇。4.5 乙酸。4.6 浓盐酸。4. 7 乙酸铀。l GB/T
5、 20746-2006 4.8 二甲基甲酷肢。4.9 乙酸乙醋。4.10 中性氧化铝.200目300目。4. 11 乙脂+乙酸乙醋溶液(1十1)。4.12 甲酸乙酸乙醋梅液:2%。向400mL乙酸乙醋中加入10mL甲酸，用乙酸乙醋定容至500mL。4.13 甲酸悔液:0.6%。量取6.0mL甲酸，用水洛解、定容至1L。4.14 甲酸梅砸:0.1%。量取1.0 mL甲酸，用水溶解、定容至1L，4.15 甲酸+甲醇榕液09+1)。用190mL甲酸榕液(4.14)与10mL甲醇(4.1)混合。4. 16 盐酸榕液:0.1mol/L。量取8.3mL被盐酸，用水潜解、定容至1L。4. 17 盐酸溶液:0
6、.3mol/L。量取25mL故盐酸，用水榕解、定容至1L。4. 18 Protease蛋白酶:SigmaP5147或相当者，一18C以下保存。4. 19 蛋白酶水梅液:0.01g/mL。称取1.00 g Protease蛋白酶(4.18)，用水溶解、定容至100mL, 4 C 保存。4.20 乙酸搭液:10%。量取100mL甲酸，用水榕解、定容至1Lo 4.21 乙酸铀榕被:0.05mol/L , pH =70称取6.8g乙酸铀用800mL水溶解，再滴加10%乙酸潜被以调节榕液pH=7，用水定容至1Lo 4.22 乙酸铀十甲酶梅液(19十1)。用190mL乙酸铀梅液(4.21)与10mL甲醇(
7、4.1)棍合。4.23 甲晖+水溶破0+的。4.24 Tris碱:SigmaT1503或相当者。4.25 Tris搭液:1. 0 mol/L。称取121g Tris碱，用水榕解、定容至1L , 4 C保存。4.26 卡巴氧、脱氧卡巴氧、嗤略琳-2-搂酸、3-甲基喳口恶琳-2-捷酸、喳略i称-2呵接酸-d4标准物质:纯度二三99%。4.27 标准储备榕液:100 mg/L。准确称取适量标准物质，卡巴氧用二甲基甲酷胶榕解定容，其余标准物质分别用甲醇溶解定容，配成100mg/L的标准储备攘，在一18C保存，可使用l年。4.28 基质1昆合标准工作榕液:根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓
8、度(g/L)的基质掘合标准工作需液，在4C保存，可使用1周。4.29 内标工作榕液:准确称取适量内标标准物质，用甲醇榕解定容，配成100g/L的标准工作洛液，在4C保存，可使用1周。4.30 阴离子交换柱:Oasis MAX 60 mg , 3 mL，或相当者。用前分别用3mL甲醇和3mL水活化，保持柱体温润。4.31 掳膜:O. 2mo 5 仪器5. 1 液相色谱田串联质谱仪:配有电喷雾离子源。5.2 固相萃取装置。5.3 氮气撒缩仪。5.4 被体?昆匀器。5.5 分析天平:感量0.1mg和0.01go 5.6 真空泵。5. 7 均质器。5.8 移液器:10L100L和100Ll000L。5
9、.9 聚丙烯离心管:50mL，具蠢。5. 10 pH计:测量精度土0.02pH单位。5. 11 低温离心机:可制冷到4.C。5. 12 玻璃离心管:15 mLo 6 试样制备与保存6. 1 试样的制备G/T 20746-2006 将牛、猪肝脏和肌肉组织样品充分搅碎，均质，分出O.5 kg作为试样，置于清洁样品容器中，密封，并做上标记。6.2 试样的保存将制备好的试样于一18.C以下保存。7 测定步骤7. 1 卡巴氯的前处理步骤7. 1. 1 称取5gi式样，精确至0.01g。置于50mL聚丙烯离心管中，加入5g中性氧化铝(4.10)。7. 1.2 加入25mL乙腊+乙酸乙醋溶液(4.11)，于
10、液体棍匀器上充分由合5min，以5000 r/min离心5 min，将上清液移取至另一干净的50mL离心管，加入10mL正己烧(4.4)到管内，撮荡2min，以5 000 r/min离心5min，弃去上层E己烧，将下层清液转移至150mL鸡心瓶中。7. 1. 3 重复7.1. 2步骤-j，合并两次提取液于同一鸡心瓶中，加入一定量的喳略琳-竣酸-d4标准梅液(4.29)，使其榷度为2.0ng/g，40.C水浴，减压旋转蒸发至干o7. 1. 4 准确加入1.0 mL甲酸+甲醇溶液(4.15)擂解残渣，过O.2m惊膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.2 脱氧卡巴氧、睡眼琳-2-搓酸、3-甲基睡。恶
11、琳号竣酸的前处理步骤7. 2. 1 称取5g试样，精确至0.01g.置于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL O. 6%甲酸潜液(4.13)，Y昆匀后，置于(47土3).C振荡水浴中振摇1h;先加入3mL 1. 0 mol/L Tris溶液(4.25)r昆匀，再加入0.3mL蛋白酶水梅液(4.19)，充分棍匀后，置于(47士3).C振荡水陆中酶解16h18 h。加入20 mL O. 3 mol/L盐酸梅液(4.17)，振荡5min，在10.C以5000 r/min离心15min，上清拖过滤。7.2.2 将愤掖(7.2.1)移人OasisMAX国相萃取柱(4.30)中，待样液全部流出后，用30m
12、L乙酸饷十甲醇潜液(4.22)淋洗固相萃取柱，真空抽干15min. 7.2.3 在一支干净的玻璃管内加入一定量的哇略琳-2-竣酸-d4标准恪液(4.29)，使其被度为2.0 ng/g，再用4X3mL二氧甲惋将脱氧卡巴氧洗脱至管内，在45.C用氮气浓缩仪吹干。7.2.4 固相萃取柱再用3X3mL甲醇、3mL水、3X3mL O. 1 mol/L盐酸恪液(4.16)和2X3mL甲醇十水梅液(4.23)分别淋洗，真空抽干15min，然后用2mL乙酸乙醋再淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出破，最后用3mL甲酸乙酸乙醋榕液(4.12)洗脱喳略I称号-援酸和3-甲基喳H恶琳-2-搜酸到7.2.3所用试管中，在45
13、.C用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0 mL O. 1 %甲酸十甲醇溶液(4.15)榕解残渣，过O. 2m滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.3 色谱测定7.3. 1 液相色i普条件a) 色谱柱:Inertsil ODS-3 , 3m， 100 mmX2. 1 mm (内径)或相当者;川流动相:甲酶、乙腊以及0.1%甲酸榕破，梯度洗脱条件见表1; c) 流速:0.2mL/min; 3 GBjT 20746-2006 d) 柱温:300C ; 的进样量:30Lo时间/min。10.0 10.1 13. 1 20.0 质i普条件7.3.2 a) b) c) d) e) f) 离子惊:电喷扫描方式:
14、检视方式z分辨率:电喷雾g) 气帘h) 辅助i)离表2化合物名称卡巴氧喳略琳-2-竣酸脱氧卡巳氧Eh500C; 明定量离子表1梯庭洗脱条件甲醇/c%)乙脯/c%)13 7 45 15 64 16 179.2/133.2 189.2/143.1 3-甲基喳H恶琳-2-竣酸I-.-, -_.- I 189.2/145.1 I 179.2/133.2 189. 2/145. 1 26 26 7.4 班相色谱喃串联质i普测定7. 4. 1 定性测定140 150 .120 120 0.1%甲酸/c%)80 40 20 80 80 电压/碰撞池出V 口电压/V 一49 8 19 18 23 12 一21
15、 12 49 8 31 10 23 12 21 12 每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待棚物质的保留时间，与棍合标准工作榕液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内，各分析化合物的参考保留时间见表3;样品中各组分定性离子的相对丰度与被度接近的海合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表4规定的班围，则可判定为样品中存在对应的待测物。化合物名称保留时间/min相对离子丰度允许的最大偏差7.4.2 定量测定表3各分析化合物参考保留时间卡巳氧喳H恶I淋-2-梭酸脱氧卡巴氧9.11 9. 95 14.43 表4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差5
16、0 2050 1020 土20土25士30GB/T 20746-2006 3-甲基喳嗨l林-2-竣酸10. 97 % 运二10士50用混合标准工作榕液(4.28)合物和内标化合物的故度比为:J巴氧、脱氧卡巴氧、喳口恶琳吨峰面积比为纵坐标，以分析化进行定量，样品踏破中卡应酬-2按酸的响应值均脑仪前1定的线性范围内。卡巴氧、脱氧卡巴氧、喳略琳7.5 平行试验接以上步骤，对同7.6 回收率试验阴性样品中8 结果计算试样中每种化式中:X一一试样中盟阳也C，一一基质标A一一试样榕被As-基质标准工1，Ci一一试样溶被中Csi一一基质标准工作Ai一一基质标准工作梅A广一一试样搭液中内标物的可基喳H罪!淋-
17、2-接酸的标准总离子流图V一一样液最终定容体积，单位m一一试样溶液所代表试样的质量，注:计算结果应扣除空白值。9 精密度白值2r . ( 1 ) 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379. 2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。9. 1 重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，组织中四种分析化合物的含量范围及重复性方程见表505 GB/T 20746一2006表5含量范围及重复性和再现性方程化合物名称含盘范围/(Ilg/kg) 基质重复性限r再现性限R猪肉19 r=O. 8440 19 m-1. 0221 19 R=O.
18、 788 9 19 m一0.8393卡巴氧0.5-5.0 猪肝19 r=O. 8338 19 m一0.8836 19 R=O. 7944 19 rn一0.814猪肉19 r=O. 9146 19 m-O. 9994 19 R=O. 978 1 19 m-O. 786 6 脱氧卡巴氧0.5-5.0 猪肝19 r=O. 783 1 19 m-O. 9677 19 R=O. 741 2 19 m-O. 781 2 猪肉19 r=O. 829 8 19 m一0.9644 19 R=O. 940 5 19 1/1-0. 826 3 喳l略琳-2-竣酸0.5-5.0 猪肝19 r=O. 8849 19 m
19、-O. 9l:-l 19 R=O. 793 5 19 m一0.7782 猪肉19 r=O. 971 5 19 m-O. 976 19 R=O. 776 0 19 m-O. 721 2 3-甲基i娶H悲i琳-2-竣酸0.5-5.0 猪肝19 r=O. 834 6 19 m-O. 919 8 19 R=O. 755 5 19 m-O. 723 8 注:m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R.组织中四种分析化合物的含量范围及再现性方程见表506 7.5eiJ, 7.
20、0e4 6.5e4 5.5e4 5. Oe4 ,) 喜4.0e4 3.5e4 3.0e4 Z. 5e4 2.79 1. 5e4 1. Oe4 1. 49 1 0.0 l 2 B 4 5 1一一卡巴氧，9.11miu; 2一一喳嗯琳-2-竣酸，9.95 min; 3一-3-印基喳略琳-2-竣酸，10.97 min; 4一一脱氧卡巴氧，14.43，E 附录A(资料性附录)标准物质总离子流固10.87 3 1 11 11 2 11 11 9.95 I , I I 8. 2 1 ) ) , 7 B 9 10 11 12 圈A.1 标准样晶总商子流图GBjT 20746-2006 14.43 4 1 1
21、6.20 I n 18.42 13 14 15 16 17 18 19 20 tlmin G/T 20746-2006 UGON-守hONH阁。附录B(资料性附录)回收率本方法中卡巴氧、脱氧卡巳氧、喳H恶I琳-2-搓酸、3-甲基I璧H恶I琳-2-捷酸在四种基质中的器加陆度及其平均回收率的试验数据，见表B.1o表B.1 四种目标化合物添加浓度及其平均回收翠的试瑜数据平均回收率/(%)药物名称添加浓度!(g/kg)猪肉猪府牛肉牛肝0.5 79.8 80. 2 81. 4 84.8 1. 0 89.1 90. 1 89.7 89.0 卡巴氧2.0 89.6 9l. 1 92.0 92.3 5.0 8
22、7.2 89.2 85.8 86.8 0.5 83.0 82.2 81. 8 78.8 1. 0 87.3 87.0 92.1 91. 6 脱氧卡巴氧2.0 96.7 89. 1 94. 9 96. 6 5.0 84.6 83. 1 83.0 85.0 0.5 81. 8 80.0 80.8 80.2 1. 0 87.5 88.0 86.7 84.9 哇恶琳-2-竣酸2.0 92. 9 94.9 92.7 94. 9 5.0 85.4 84.2 86.0 82. 8 0.5 76.2 77.6 78.0 7击.21. 0 86. 4 84.8 83.2 85.2 3-甲荔蜜曙H怵-2-竣酸2.0 94. 6 96.2 93.9 92.8 5.0 82.2 82.8 81. 4 84.8 版权专有侵权必究特书号，155066 1-28932 GB/T 20746-2006 定价:14.00元
