1、 ICS 65.120 B 46 备案号： 16714-2005 浙 江 省 地 方 标 准 DB33 DB33/T 538 2005(2013) 饲料中卡巴氧的测定 高效液相色谱法 Determination of carbadox in feedstuffs High-performance of liquid chromatography 2005-02-17 发布 2005-03-18 实施 浙江省质量技术监督局 发布 DB33/T 538 2005(2013) I 前 言 本标准在参阅了国外文献资料的基础上，采用净化小柱纯化，再用高效液相色谱仪 (配紫外检测器 )进行测定。 本标准由
2、浙江省农业厅提出并归口。 本标准由浙江省饲料监察所负责起草。 本标准主要起草人：施杏芬、金海丽、宣士荣、张志健、陈勇、朱聪英、周剑萍。 DB33/T 538 2005(2013) 1 饲料中卡巴氧的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准 规定了饲料中卡巴氧的测定 -高效液相色谱法。 本标准 适用于饲料中卡巴氧的测定。 本标准 最低检测浓度为 0.5mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准 的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注
3、日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样方法 3 方法原理 试样中的卡巴氧先用三氯甲烷 +甲醇溶液提取，通过液 液萃取、 HLB 小柱净化，再用甲醇洗脱。以甲醇 +水作为流动相，用高效液相色谱仪 (带紫外检测器 )测定，外标法定量。 4 试剂和 材料 4.1 除特殊说明外，本标准所用 试剂均为分析纯，水为三级水，色谱用水为一级水，符合 GB/T 6682中用水规定 。 4.2 三氯甲烷。 4.3 甲醇 (色谱纯 )。 4.4 氢氧化钠 。 4.5 氯化钠 。 4.6 磷酸二氢钾。 4.7 (0.1mol/L
4、氢氧化钠 +10%氯化钠 )混合液： 称取 4.0g NaOH 和 100gNaCl 溶于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至 1000mL。 4.8 1mol/L 磷酸二氢钾溶液：称取 136 g KH2PO4溶于蒸馏水中，再用蒸馏水定容至 1000mL。 4.9 三氯甲烷 +甲醇溶液 (V+V)=3+1。 4.10 色谱净化柱： HLB 小柱 60mg/3mL。 4.11 冰醋酸 。 4.12 0.45 m 滤膜：有机滤膜。 5 仪 器、设备 5.1 实验室常用仪器设备。 5.2 真空泵 (0.1Mpa)。 5.3 恒温水浴锅。 5.4 旋转 蒸发 仪。 5.5 旋涡 混合 仪。 DB33/T 53
5、8 2005(2013) 2 5.6 超声波 提取器。 5.7 高效液相色谱仪 (配紫外检测器 )。 6 试样的制备 按 GB/T 14699.1 采样， 选取有代表性的饲料样品至少 500，四分法缩减至 100，磨碎，全部通过 0.42 孔径分析筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。 7 分析步骤 7.1 条件 检验过程应在避光条件下快速进行。 7.2 提取 准确称取 10g(精确至 0.001 g)混匀的试样于 250mL 锥形瓶中，加 2 g 左右的硅藻土。在锥形瓶中加入 100mL 左右的三 氯甲烷 +甲醇溶液 (4.8)，常温超声 20 分钟，冷却至室温。用 60mL 玻璃砂芯
6、漏斗 (孔径为 3 )过滤到 500mL 抽滤瓶中，把抽滤瓶中的滤液倒入另一 250mL 锥形瓶中；再取 40mL 三氯甲烷 +甲醇溶液（分两次，每次 20mL）于有试样的锥形瓶，振摇，抽滤，滤液合并至 250mL 锥形瓶中。 将锥形瓶放于蒸汽浴上，蒸发溶液至近干。加 20mL 三氯甲烷于棕色锥形瓶把残渣转移至 150mL分液漏斗，再用少量三氯甲烷洗涤锥形瓶 (2-3 次 )，洗液合并到 150mL 分液漏斗。在分液漏斗中加入20.0mL(0.1mol/L 氢氧化钠 +10%氯化钠 )混合液（ 4.6），振摇 2 分钟 (边振摇边放气 )，静置分层，弃去三氯甲烷层。再用三氯甲烷洗涤水相 2 次
7、，每次用量 20mL，洗涤后弃去。加 4.0mL 1mol/L 磷酸二氢钾溶液（ 4.7）于水相中，摇匀，备用。 7.3 纯化 先分别用 3mL 甲醇和 3mL 水对 HLB 小柱进行活化，取备用液（ 7.1） 5.0mL 上小柱，用 3mL 水淋洗小柱（挤干），加 5.0mL 甲醇洗脱 (挤干 )。收集洗脱液于小试管中 (加盖 )，旋涡混匀， 洗脱液过 0.45 m 滤膜 (4.11)，上机测定。 7.4 卡巴氧标准溶液的制备 （应现配现用） 7.4.1 卡巴氧标准溶液：精 确称取 20mg 卡巴氧标准品 (精确至 0.00002 g)于 100 mL 棕色容量瓶中，用三氯甲烷 +甲醇溶液常
8、温超声溶解，冷却。用三氯甲烷 +甲醇溶液定容并摇匀。此溶液浓度为 200g/mL。 7.4.2 卡巴氧 标准 工作溶液：分别吸取贮备液 0.1mL、 0.5mL、 1.0mL、 1.5mL、 2.0 mL 于 10mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，标准工作溶液系列浓度分别为 2 g/mL、 10 g/mL、 20 g/mL、 30 g/mL、 40g/mL。过 0.45 m 滤膜 (4.11)，上机测定。 7.5 测定 7.5.1 高效 液相色谱条件 色谱柱： C18 (5 m， 4.6250mm)； 检测波长： 308nm； 流动相：甲醇 +水 =3+7，每 1000ml 混合液中加 2 mL
9、 冰乙酸； 流速： 1.0mL/min； 进样体积： 20 L。 7.5.2 上机测定 卡巴氧标准工作溶液和试液 (上机液 )分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积进行计算。 7.6 结果的计算与表述 7.6.1 计算公式 结果按式 (1)计算： DB33/T 538 2005(2013) 3 X= CV2 (1) 1 式中： X-试样中卡巴氧含量， mg/kg； C-试液 (上机液 )中卡巴氧的浓度， g/mL； V1-试液 (上小柱 )体积， mL； V2-试液 (洗脱液 )体积， mL； m-试样质量， g； -稀释倍数。 7.6.2 结果表示 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数 3 位。 8 允许 差 同一分析者对同一试样同时两次测定 (或重复测定 )所得结果相对偏差不大于 15%。 _
