1、ICS 67050X 04 a雪中华人民共和国国家标准GBT 22984-2008牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of the residues of metabolites of carbadox andolaquindox in milk and milk powderLCMSMS method2008-12-31发布 2009050 1实施宰瞀粥鬻黼警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“。刖 嚣GBT 22984-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归1：3。本标准起草
2、单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林黎、谢丽琪、欧阳姗、梁宏、叶刚、廖菁菁、庞国芳。1范围牛奶和奶粉中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22984-2008本标准规定了牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹嘌啉一2一羧酸(quinoxaline-2一carboxylic acid)和喹乙醇代谢物3一甲基喹暖啉一2一羧酸(3一methyl quinoxaline-2一carboxylic acid)残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中卡巴氧代谢物喹嘿啉一2一羧酸(quinoxaline-2一ca
3、rboxylic acid)和喹乙醇代谢物3一甲基喹嚼啉2一羧酸(3一methyl quinoxaline-2一carhoxylic acid)残留量的测定。本标准的方法检出限：喹嚼啉一2一羧酸和3一甲基喹嚼啉一2一羧酸的方法检出限牛奶为05 pgkg，奶粉为40 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注El期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与
4、精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792-2004，ISO 57252：1 994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理用甲酸溶液消化试样，使牛奶和奶粉中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，固相萃取柱净化，液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB
5、T 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42甲酸：色谱纯。43乙酸钠。44乙酸乙酯。45 z甲酸一乙酸乙酯溶液：向400 mL乙酸乙酯中加入10 mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500 mL。46 06甲酸溶液：量取60mL甲酸，用水溶解、定容至1 L。47 01甲酸溶液：量取10 mL甲酸，用水溶解、定容至1 L。48 甲酸一甲醇溶液(19+1)：用190 mL甲酸溶液(42)与10 mL甲醇(41)混合。49 01 molL盐酸溶液：量取83 mL浓盐酸，用水溶解、定容至1 L。410 0，3 molL盐酸溶液：量取25 mL浓盐酸，用水溶解、定容至1 L。IGBT 22984-200841
6、1 Protease蛋白酶：SigmaPSl47或相当者，一18以下保存。412 001 gmL蛋白酶水溶液：称取100 g Protease蛋白酶(411)，用水溶解、定容至100 mL，4保存。413 10乙酸溶液：量取100 mL乙酸，用水溶解、定容至l L。414 005 moIL乙酸钠溶液：称取68 g乙酸钠用800 mL水溶解，再滴加】o乙酸溶液以调节溶液pH一7，用水定容至1 L。415乙酸钠一甲醇溶液(19+1)：用190 mL乙酸钠溶液(414)与10 mL甲醇(41)混合。416 甲醇一水溶液(1+4)。417 Tris碱：SigmaTl503或相当者。418 10 mol
7、L Tris溶液：称取12l g Tris碱(417)，用水溶解、定容至1 L，4保存。419喹曙啉一2羧酸、3一甲基喹嚼啉一2一羧酸、喹暖啉一2一羧酸一d4标准物质：纯度99。420标准储备液：100 mgL。准确称取适量标准物质，分别用甲醇溶解定容，配成100 mgL的标准储备液，在一18以下保存。421基质混合标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用空白样品提取液配成不同浓度(ggL)的混合标准工作溶液，在4保存。422内标工作溶液：准确称取适量喹嚼啉一2一羧酸一d4标准物质，用甲醇溶解定容，配成100tgL的标准工作溶液，在4保存。423 Oasis MAX固相萃取柱”或相当者：60 m
8、g，3 mL。用前分别用3 mL甲醇和3 mL水活化，保持柱体湿润。424滤膜：02 pm。5仪器和设备515253545556575859510液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。固相萃取真空装置。吹氮浓缩仪。旋涡振荡器。分析天平：感量01 mg和001 g。真空泵。低温离心机：可制冷到4，转速大于5 000 rrain。移液器量程：10L100弘L和100 pL1 000弘L。聚丙烯离心管：15 mL和50 mL，具塞。pH计：精度土002pH单位。6试样制备与保存61试样的制备取不少于500 g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并作上标记。62试样的保存牛
9、奶置于4冰柜中避光保存，奶粉则于室温下置于干燥器保存。Z1)Oasis MAX固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GBT 22984-20087测定步骤71提取711牛奶准确称取5 g牛奶样品(精确到001 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入一定量的内标溶液(422)，使其浓度为20 ngg，再加入10mL 06甲酸溶液(46)，混匀后，置于(473)振荡水浴中振摇l h；然后先加入3 mL 10 molL Tris溶液(418)，再加入03 mL蛋白酶水溶液(4
10、12)，充分混匀后，置于(47士3)振荡水浴中酶解16 h-18 h。加入20 mL 03 molL盐酸(410)，振荡5 min，在10以5 000 rmin离心15 rain，上清液过滤。712奶粉取125 g奶粉于烧杯中，加适量3550水将其溶解，待冷却至室温后，加水至总质量为100 g，充分混匀后准确称取5 g样品(精确到001 g)，置于50 mL聚丙烯离心管中，按711步骤进行处理。72净化将71所得溶液以约1 mLmin的流速全部通过Oasis MAX固相萃取柱(423)，分别用15 mL乙酸钠一甲醇溶液(415)淋洗固相萃取柱，真空抽干15 rain。再用5 mL甲醇、3 mL
11、水、5 mL 01 molL盐酸(49)和3 mL甲醇一水溶液(416)分别淋洗，真空抽干15 rain，然后用2 mL乙酸乙酯淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出液，最后用3 mL甲酸一乙酸乙酯溶液(45)洗脱喹嘿啉一2一羧酸和3一甲基喹嘿啉一2羧酸，置于15 mL聚丙烯离心管中，在45用氮气浓缩仪吹干。准确加入10 mL甲酸一甲醇溶液(48)溶解残渣，过02 btm滤膜，供液相色谱一串联质谱仪测定。73空白基质溶液的制备称取阴性样品5 g(精确到001 g)，按71和72步骤操作。74测定条件741液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：ODS，3 pm，100 mm21 ram(内径)
12、或相当者；b)流动相：甲醇、乙腈以及01甲酸溶液(时间梯度见表1)表1流动相时间梯度时间rain 甲醇 乙腈 0 1甲酸00 13 7 8010 0 45 15 4010 1 64 16 20131 13 7 80200 13 7 80c)流速：02 mLmin；d)柱温：30；e)进样量：30 pL。742质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源b)扫描方式：正离子扫描c)检测方式：多反应检测GBT 22984-2008d)分辨率：单位质量分辨率；e)电喷雾电压：5 000 V；f)雾化气流速：80 Lmin；g)气帘气流速：70 Lmin；h)辅助气流速：50 Lmin；i)
13、离子源温度：450；j)定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表2。表2各种化合物的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞电压、碰撞池出口电压定性 定量 定量内标 去簇 聚焦 碰撞 碰撞池出口化合物名称 离子对 离子对 离子对 电压 电压 电压 电压(mz) (，z) (优z) V V V V175O1292 26 120 23 12喹噫啉一2一羧酸 17501312 1792133217501312 26 120 21 1218921431 26 120 23 123一甲基喹唔啉一2一羧酸 18921451 1792133218921451 26 120 21 12743液相色谱一串联质谱测
14、定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间，与混合标准工作溶液中对应的保留时间偏差在士25之内，各分析化合物的参考保留时间见表3，样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表4规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3分析化合物参考保留时间化合物名称 保留时间rain喹嘧啉一2一羧酸 10103甲基喹嚼啉2一羧酸 111l表4定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20(K50 10K20 K10允许最大偏差 士20 士25 士30 士50
15、7432定量测定用混合标准工作溶液(421)分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中喹暖啉一2一羧酸和3一甲基喹暖啉一2一羧酸的响应值均应在仪器测定的线性范围内。喹嘿啉一2一羧酸和3一甲基喹嚼啉一2一羧酸标准物质提取离子流图参见附录A中的图A1和图A2。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76回收率试验阴性样品中添加标准溶液，按步骤711713操作，测定后计算样品添加的回收率。本方法中喹嘿啉一2一羧酸和3一甲基喹嚼啉一2一羧酸在两种基质中的添加浓度及其平均回收率的试验数
16、据参见附录B中的表B1。4GBT 22984-20088结果计算试样中每种化合物残留量按式(1)计算：x会毒筹筹獬式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；Cs基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；ci试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应
17、扣除空白值。9精密度91一般规定本方法的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性实验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，样品中两种分析化合物的添加浓度范围及重复性方程见表5。表5 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为毫克每千克化合物名称 样品基质 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R牛奶 o 55o lg r一0879 7lgm 1017 9 lgR一0844 5lgm一0648 9喹嚼啉一2一羧酸奶粉 40400 lg r-0956 1 lgm 1055 4 lgR一0757 8l
18、gm一0616 3牛奶 0550 19 r一0869 7lg m-11 077 2 19R-0 724 0lg0 649 23甲基喹嚼啉2羧酸奶粉 40400 lg r一0 9821lgm一0 9851 lgR一0860 0 190 599 7注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性实验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，样品中两种分析化合物的添加浓度范围及再现性方程见表5。GBT 22984-2008附录A(资料性附录)标准物质提取离子流图喹唔啉一2一羧酸(QCA)和同位素内标(QCAd4)标
19、准物质提取离子流图，见图A1；3甲基喹嚼啉一2羧酸(MQCA)和同位素内标(QcAd4)标准物质提取离子流图，见图A2。6 000J。“44。00。014099 2。0。溢1 I赫赫泓j11铽042一帆。黼I赫赫泓l铽 o_1百而2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20train “图A1 喹曝啉-2-羧酸(QCA)和同位素内标(QCA-d4)标准物质提取离子流图L00e4 J MQCA图A2 3一甲基喹曝啉一2一羧酸(MQCA)和同位素内标(QCAd4)标准物质提取离子流图氅妇竣l忆。斟婚踮h瓣咖咖咖监拦J加盯曲。叩A_咖咖。3，
20、)，：1昕凹。“一一鬻一附录B(资料性附录)回收率GBT 22984-2008本方法中喹嚼啉一2一羧酸和3一甲基喹嚼啉一2一羧酸在牛奶和奶粉中添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 喹嚼啉-2-羧酸和3一甲基喹嗯啉一2一援酸在牛奶和奶粉中添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称 样品基质 添加浓度(pgkg) 平均回收率“05 83110 757牛奶20 80550 899喹嚼啉一2一羧酸40 7918O 856奶粉16 0 877400 88705 77 410 853牛奶20 72150 7913一甲基喹嚼啉一2一羧酸40 7508 0 853奶粉160 884400 770
