1、ICS 67.050 X 04 中华人民圭K.;、手口国国家标准G/T 20749-2006 牛尿中存雌二醇残留量的测定气相色谱m负化学电离质谱法Method for determination of Il-estradiol residues in bovine urine一gas chromatography-negative-ion chemical ionization mass spectrometry method 2006国12回31发布中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2007国03-01实施发布. .回回目。昌本标准的附录A和附录B为资料性附录。本
2、标准由中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。GB/T 20749-2006 本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:庞国芳、王建华、李杰、刘靖靖、蔡发。本标准系首次发布的国家标准。I 1 范围牛尿中萨雌二醇残留量的测定气相色谱-负化学电离质谱法GB/T 20749-2006 本标准规定了牛尿中日-J帷二醇残留量气相色谱-负化学电离质谱测定方法。本标准适用于牛尿中叫二醇疏醋销古队本标准的方法检出限:O. 2 规范性引用文件下列文件中的的修改单(不包括勘CGB/T 6379.
3、 1刷GB/T 637 rJ!. 2 性与再现性的GB/T 66 3 原理牛尿中Jit佳择离子监测模1 000单位/mLc4.2 甲醇:色谱纯。4. 3 四丁基甲酷4.4 乙酸乙醋:色谙纯。4.5 正己脆:色i普纯。4.6 日比脆:色谱纯。4. 7 异辛皖:色i普纯。4. 8 衍生化试剂:五氟苯甲酷载，在避光、防潮环境冷冻储藏。4.9 碳酸氢何。4. 10 三水乙酸铀。4. 11 元水硫酸铀。4. 12 甲醇十水潜液(1十1):取100mL甲醇(4.2)和100mL水充分混合。的引用文件，其随后所有准达成协议的各方研究本标准。第飞部分z总则与定义标准测量方法重复36自6:1987) 化学电离质
4、谱选单位/mL，硫酸醋酶4. 13 甲醇十四丁基甲酷梅液0+9):取20mL的甲醇(4.2)和180mL四丁基甲酷(4.3)充分棍合。4. 14 乙酸铀缓冲破CpH=5.2):称取43g三水乙酸铀(4.10)用水溶解，加入25.2g冰乙酸用水定容G/T 20749-2006 至1000 mL，有效期6个月。4. 15 干燥乙酸乙酣:在密封试管中加人500mg元水硫酸铀和20mL乙酸乙醋，振荡晦合约30min 后，2000r/min离心10mino 4. 16 乙酸乙醋+毗陡(90十10):将10mL毗院和90mL干燥的乙酸乙醋棍合，室植保存。一周内使用回4. 17 股酸氢饵CKHC03)榕破:
5、O. 5 mol/L。称5g KHC03于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。一周内有效。4. 18 Oasis HLB固相萃取柱:60mg , 3 mL或相当者。使用前分别依次用3mL四丁基甲酣C4. 3) , 3 mL甲醇(4.2),3 mL纯水活化，保持柱体湿润。4. 19 标准物质:-雌二醇，纯度二三99%。4.20 内标标准物质:-雌二薛，4，16，16-D4，纯度99%。4.21 自-Jt佳二醇标准陪液t准确称量10mg标准物分别于100mL容量瓶中，用甲醇(4.2)定容至刻度，被度100g/mL，储备被贮存于一200C，有效期-年。再以甲醇稀释成适用被度的潜攘，保存于40C冰箱中
6、。4.22 内标标准榕掖:准确称量10mg标准物分别于100mL容量瓶中，用甲醇(4.2)定容至刻度，被度100g/mL，储备液贮存于一20.C，有效期一年。再以甲醇稀释成适用坡度榕液，保存于4C冰箱中，可使用三个月。4.23 标准工作榕破:将-雌二醇标准溶液(4.21)和萨雌二醇D4(4.22)泪合，按照7.3步骤衍生化后备用。5 仪器5. 1 气相色谱-质谱仪:配有负化学源。5.2 离心管:5mL和10mL，具塞。5. 3 移液器:20L100L，200Ll000L。5.4 分析天平z感量0.1mg和0.01go 5.5 离心机。5.6 祸旋沮匀器。5. 7 氯气故缩仪。6 试样的制备与保
7、存6. 1 试样的制备取有代表性样品，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。6.2 试样保存将试撵置于2C80C下保存。7 酣定步骤7. 1 提取准确移取2.0mL牛尿，置于5mL具塞离心管中，加入2mL乙酸铀缓冲被(4.14)、20L-葡糖昔酸酶和芳基疏酸背酶(4.1)、100L内标榕被(4.22)于每个样品中，t昆匀，于370C过夜。7.2 净化将提取被(7.1)移入下接OasisHLB柱(4.18)的贮破器中，榕被以1mL/min !w流速通过Oasis日LB柱，待榕被完全流出后，用甲醇十7.1.(4.12)眈柱，弃去全部淋出液。最后用6mL甲醇十四丁基甲酷(4.
8、13)洗脱，收集搅脱液于10mL具事离心管(5.2)中，用氯气被缩仪(5.的吹至约剩余500L榕GB/T 20749-2006 液。加入2X2mL异辛烧于上述10mL离心管中提取两次，以2000r/min离心5min。取上层蔽体于5 mL具塞离心管(5.2)，于40C下氮气吹干。7.3 衍生化在上述5mL具塞试管中依次加入85L干燥乙酸乙醋(4.1日，500L乙酸乙醋十毗睫(4.16) , 20L五氟苯甲酌氯(4.8) ，说匀，于60C放置20min后，用氮气浓缩仪吹干。加入500L0.5 mol/L KHC03溶液(4.17)，涡旋振荡，待洛被澄清后，准确加入0.4mL异辛烧，由合提取，静置
9、，取上清液进行测定。7.4 测定7.4. 1 气相色谱-质i曹测定条件a) 色i普柱:HP-5MS (30 mXO. 25 mmXO. 25m)石英毛细管柱或相当者;b) 载气:氮气，纯度二三99.999%; c) 流速:初始流速1.0 mL/min，保持5min，然后以1.0 mL/min速度升至3mL/min; d) 柱温:120C保持2min，然后以15C/min程序升温至250C，再以5C/min升温至300C保持8 min; 的进样量.1L; f) 进样方式z无分流进样;g) 进样口温度:300C ; h) 接口温度:280oC;i) 负化学惊:150eVij) 离子掘温度:1500
10、C ; k) 四极杆温度:1060C;1) 反应气:甲烧，纯度注99.99%;m) 反应气流量:2 mL/min; n) 选择离子监测，见表L监视l离子Cm/z)660 661 448 450 7.4.2 定性测定定性测定的依据为:表1选择离子监泪表离子比/C%)100 40 80 44 a) 被测样品色谱峰的保留时间与标准工作榕摄相致;允许相对偏差/c%)土20士20士20b) 所选择的离子均出现，被测样品的监测离子的相对丰度与标准工作榕腹的相对丰度两者之差不大于允许相对偏差(7.4.1)。7.4.3 定量测定配制系列标准工作瞎掖(4.23)分别进样.仪器测定雌二醇以m/z660为定量离子，
11、内标雌二晖D4以m/z664为定量离子，以峰面积比对榷度绘制标准工作曲线，用标准工作曲线内标法对样品进行定量，样品榕液中待测物质的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，雌二醇衍生物参考保留时间约为26口Ullo雌二回事和内标衍生物总离子流图和质谱图参见图A.1、图A.2、图A.30 7.5 平行试验以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。3 GB/T 20749-2006 7.6 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。8 结果计算结果按式(1)计算nuxu nu-nu nu-nu 吨-A-哈t， v-m pau -X . ( 1 ) m一一样品陪液所代表，注:计算结果应扣除空9
12、 精密度本标准的精密值以95%的可信9. 1 重复性在重复性条扑鼻尿中雌都躏槛酶0.2岛5的绝对差值不式中:副.( 2 ) 一-一一9.2 再现性在再现性的绝对差值不超次独立测试结果. -11- ( 3 ) 式中:4 附录A(资料性附录)雌二醇和内标衍生物总离子流固和质i普圄A.l 雌二薛和内标衍生物总离子流图，见图A.10 A.2 雌二醇标准A.3 Abundance 550 000 500 000 Abundance 100000 900心。80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 。m!z一50 (自660 、棉现664 452 10
13、0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 图A.3雌二醇D4标准物质衍生物质谱圄GB/T 20749-2006 5 G/T 20749-2006 附录B(资料性附录)回收率本方法中雌二醇添加浓度及其平均回收率的试验数据:日在O.25g/L时，回收率为100.0%; 在0.5g/L时，回收率为71.7 % ; 在1.0g/L时，回收率为100.7%;在2.0g/L时，回收率为86.0%。CON-叶hONH筒。华人民共和国家标准牛尿中冉雌二醇残留噩的测定气相色谱-负化学电离质谱法GB/T 20749-2006 国中铃中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数12千字2007年3月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2007年3月第一版定价10.00元9峰书号:155066 1-28928 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533
