1、ICS 13.100 C 60 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 28236-20门染色体畸变估算生物剂量方法2011-12-30发布数码防伪Method of chromosome aberration analysis for biological dose assessment 中华人民共和国卫生部申#中国国家标准化管理委员会。叩2012-05-01实施目U昌本标准代替GB/T12715-1991(染色体畸变分析估算生物剂量的方法上本标准与GB/T12715-1991相比主要变化如下:G/T 28236-2011 一一补充了标准的范围也适用于一次比较均匀的全身外照射复合烧伤的病例的生
2、物剂量估算;一一将可较准确估算剂量的取血时间改成60d: 一一强调采用培养开始加秋水仙素法和用dic(或dic+r)估算剂量;一一增加了不均匀和局部照射的统计检验和生物剂量估算方法;一一原标准基本是引用IAEA第260号技术报告丛书(1986)，本标准尽量采用我国的资料，如染色体畸变图、生物剂量估算的举例、某些统计分析方法、取血有效时间和估算剂量的注意事项等。同时，也参考和引用了IAEA第405号技术报告丛书(2001)的有关内容。本标准附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所。本标准主要起草人:
3、白玉书。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T12715-1991。I GB/T 28236-2011 染色体畸变估算生物剂量方法1 范围本标准给出了电离辐射诱发人外周血淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线的建立和用其估算生物剂量的方法。本标准适用于一次比较均匀的全身外照射事故受照人员的剂量估算。本标准也适用于一次比较均匀的全身外照射复合烧伤的病例剂量估算。本标准不适用于分次照射、长期小剂量累积照射和内照射的生物剂量估算。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 生物剂量计biological dosimeter 用以估算受照剂量的生物体系
4、，该生物体系受到照射后的反应与受照剂量之间存在着某种定量关系，从而可用来推定受照剂量。2.2 剂量效应曲线dose-response curve 某种物质或生物体系受到照射后的反应与受照剂量之间存在着某种定量关系，可将二者拟合成适当的数学模式，并制备出相应的刻度曲线，称之为剂量-效应曲线，可用其估算受照剂量。2.3 染色体chromosome 基因的载体。存在于细胞核内，当细胞分裂时，在碱性染料作用下着色较深。由脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质和少量核糖核酸(RNA)组成。2.4 染色体畸变chromosome aberration 正常染色体在物理、化学或生物等因素作用下发生的结构和数目上的异
5、常。2.5 染色体型畸变chromosome-type aberration 照射时处于Go或Gj期的细胞，由于在DNA合成之前，染色体以一条单体行使其功能，这时诱发的畸变，经S期复制后，形成涉及两条单体的染色体型畸变，主要包括元着丝粒断片、微小体、元着丝粒环、着丝粒环、双或多着丝粒体、倒位、易位、插入和缺失等。2.6 染色单体型畸变chromatid-type aberration 在S期受照的大多数细胞和Gz期受照的细胞，已进行DNA合成，即已形成两个独立的单体。所以只诱发染色单体型畸变，主要包括染色单体断裂、染色单体互换、染色单体间隙和等染色单体间隙等。2. 7 非稳定性染色体畸变uns
6、table chromosome aberration 非稳定性染色体畸变包括元着丝粒断片、微小体、元着丝粒环、双着丝粒体和着丝粒环。无着丝粒断片、微小体、元着丝粒环，由于无着丝粒，在纺锤体上不能定向，很快从分裂细胞中丢失。双着丝粒体和着丝粒环往往在分裂后期形成染色体桥或导致四倍体而常引起细胞死亡，将上述五种畸G/T 28236-20门变称为非稳定性畸变。2.8 稳定性染色体畸变stable chromosome aberration 倒位、易位、插入和缺失等畸变，在细胞分裂时不存在任何力学上的障碍，细胞复制不受影响，可较长时间在体内存在，称之为稳定性畸变。3 试剂配制、细胞培养和标本制备3.
7、 1 试剂配制3. 1. 1 培养灌配制3. 1. 1. 1 取RPMI-164010.4 g(原包装)，播于800mL去离子水中。3. 1. 1. 2 于上述培养液中加入抗生素，其终浓度为=青霉素100IU/mL.链霉素100IU/mLo 3. 1. 1. 3 用5%的NaHC03溶液将培养液的pH调到7.2，充分混匀后0.22m过滤除菌。3. 1. 1. 4 加入灭活的新生牛血清200mL，使其浓度占培养液总量的20% 3. 1. 1. 5将上述培养液充分混匀后，分装到灭菌的培养瓶中，每瓶4mL，置入-20oC低温冰箱保存备用。3.1.2 0.2%肝素溶班称取200mg肝素铀粉溶于100m
8、L生理盐水中，55.12kPa灭菌15mino 3. 1. 3 秋水仙素溶液(分子式:C22 H25 06 N ，分子量:399)称取秋水仙素100mg，溶于100mL生理盐水(1mg/mL)即为原液，分装成小瓶，低温保存。应用时配制成2.5月/mLo3. 1. 4 PHA干粉按使用说明配制。3. 1.5 O. 075 mol/L KCl低渗液称取5.60g KCI溶于1000 mL去离子水中，放入37oC恒温箱中备用。3. 1. 6 Giemsa染渡Giemsa染料中性甘油(CP)甲醇(AR)0.5 g 33.0 mL 33.0 mL 先将Giemsa染料放入乳钵中，加甘油后研磨片刻，移入小
9、烧杯内，放置55oC 60 oC水浴箱中2h , 用玻璃棒搅拌，榕解后加入33mL甲醇即为原液，用前按Gi巳msa:PBS=l : 20稀释。3.2 细胞培养和标本制备3.2. 1 培养开始加秋水仙素法3.2. 1. 1 将冰冻保存的培养液取出，室温下融化。3.2. 1.2 用肝素溶液湿润灭菌注射器后，抽取静脉血，于每瓶组合培养液内加入0.4mL抗凝血，平行接种2瓶，对过量受照者的样品接种不少于3瓶。根据有关信息，估计受照剂量较大(5Gy)者，接种不少于6瓶。3.2. 1. 3 加入PHA，加入量按使用说明确定。3.2. 1. 4 加入秋水仙素，最终浓度为0.04g/mL。3.2. 1. 5
10、t昆匀，标记姓名、日期，置入37oC恒温箱培养。3.2. 1. 23. 2. 1. 5的操作必须在无菌条件下进行。3.2. 1.6 培养48h50 h，取出培养瓶，去上清液。3.2.1.7 加入0.075mol/L KCl低渗液8mL，混匀，低渗10min。3.2. 1. 8 加入固定液(甲醇=冰乙酸=3: 1)1 mL预固定。3.2. 1. 9 1 000 r/min离心10min，去上清，再加固定液8mL，混匀。3.2.1.10 固定20min，再离心10min，去上清，重复固定一次。3. 2. 1. 11 冰干法制片，每片滴3滴沉淀物，过火一燃即可。3.2. 1. 12 干燥后Giems
11、a染色。3.2.2 荧光加姬姆萨(FPG)技术3.2.2.1 将冰冻保存的培养液取出，室温下融化。GB/T 28236-2011 3.2.2.2 用肝素溶液湿润灭菌注射器后，抽取静脉血，于每瓶组合培养液内加入0.4mL抗凝血，平行接种2瓶，对过量受照者接种不少于3瓶。对估计受照剂量较大(5Gy)者，接种不少于6瓶。3.2.2.3 加入PHA，加入量按使用说明确定。3.2.2.4 加Brdu(5-澳脱氧尿嘻睫核昔)，最终浓度为15g/mLo3.2. 2. 23. 2. 2. 4的操作必须在无菌条件下进行。3.2.2.5 混匀，标记姓名、日期，置入37oC恒温箱避光培养46h加秋水仙素，继续培养至
12、48h50 h 收获。3.2.2.6制片后用荧光染料处理。将标本浸入浓度为2.5g/mL的Hoechst33258溶液(避光), 40 min后用蒸馆水冲洗。3.2.2.7 晾干后往标本上滴加2XSSC溶液，标本所在玻璃板温度为50oC60 oC，用黑光灯或紫外线灯照射30mino 3.2.2.8 晾干后Giemsa染色。4 剂量-效应曲线的建立方法4. 1 照射条件和培养方法4. 1. 1 必须提供可靠的、明确的样品照射的物理剂量。受照标本应与照射源保持一定的距离以达到均匀照射的目的。有条件的实验室应建立包括不同辐射类型(如X射线、射线、中子)、不同剂量率(低LET辐射)的剂量效应曲线。在O
13、.1 Gy5. 0 Gy剂量范围内，剂量率最好大于0.3Gy/min，小于1. 0 Gy/min，至少要选择8个剂量点。4.1.2 选择23名成年健康人血样，在37oC :l: O. 5 oC条件下进行离体照射，照后在上述温度下放置2 h，然后采用培养开始加秋水仙素法或FPG技术培养，得到可供分析的第一次有丝分裂(Mj)细胞，如果采用前种方法，其秋水仙素浓度对分裂中期细胞的有效阻断率必须达到99%以上。4.2 计数分析技术4.2.1 在分析Mj细胞时，只记录染色体型畸变中的非稳定型畸变za) 无着丝粒畸变(acentrics，ace)是一对无着丝粒的姐妹染色单体，包括元着丝粒断片、微小体和无着
14、丝粒环。无着丝粒断片(acentricfragments , f) ，又称末端缺失，是一对相互平行的染色单体，有时易与等染色单体间隙相混淆，其判断标准是:如果两断端距离小于染色单体横径，视为等染色单体间隙，否则为无着丝粒断片;微小体(minutes，m)，又称中间缺失，为一对比元着丝粒断片小得多的染色单体，呈现一对染色质球状;元着丝粒环(acentricrings, ar)也称中间缺失，是一对环形的元着丝粒染色单体。b) 着丝粒环(centric rings , r)是一对具有着丝粒的环形染色单体，常伴有一对无着丝粒断片。c) 双着丝粒体(dicentric，dic)是指有两个着丝粒的染色体，
15、常伴有一对元着丝粒断片。多着丝粒体是指具有三个或三个以上着丝粒的染色体，如三着丝粒体(tricentric，tri)伴有两对元着丝粒断片，四着丝粒体(quadricentric，quadri)伴有三对无着丝粒断片。三着丝粒体计算成两个双着丝粒体，四着丝粒体计算成三个双着丝粒体，即三着丝粒体以上的，应计算成-1个双着丝粒体。在上述畸变中，双着丝粒体是估算生物剂量的最佳指标，也可将其与着丝粒环合并(双+环，dic+r)估算剂量，元着丝粒畸变是估算剂量的辅助指标(dic和r图见附录A)。3 GB/T 28236-20门4.2.2 进行显微镜下分析的工作人员，必须具有辐射细胞遗传学的基本知识和实际工作
16、经验，受过专门训练，能准确识别辐射诱发的各种染色体畸变。为避免主观因素造成的误差，应遵守以下原则:a) 建立一个选择细胞的标准，并始终坚持这一标准。例如:选择染色体长度适中、分散良好、很少重叠的中期分裂相，分析和记录46士l个染色体的中期细胞。b) 盲法阅片。c) 发现畸变时，应征得第二者确认。d) 采用图式法结合统一命名的数字、字母和符号记录畸变类型和显微镜坐标，以备审核或照相。4.2.3 一个完整的记录除了标明标本号、显微镜号、观察者、制样和观察日期以及分析细胞数外，必须能反映出畸变在细胞中的分布以及交换和组合的染色体数。4.2.4 按公式(1)计算各剂量点应分析的细胞数。式中:一一畸变细
17、胞率;n一一应分析的细胞数;n=旦二主)X 96.01 p 可在计数分析到一定数量的细胞后求得。4.3 剂量效应曲线的拟合4.3.1 根据下列四种数学模式进行曲线拟合:a) 线性模式. ( 1 ) 1(D) =a，斗b1D即y=a+bD(2 ) b) 二次方程模式1(D)二a2十C2D2即y=a+ cD2 ( 3 ) c) 二次多项式模式1(D) =3十b3D+ C3D2即y=+bD+CD2 ( 4 ) d) 罪函数模式1(D) =向+队Dn当向=0时y=kIJn ( 5 ) 式中zf一一以D为自变量的函数;y一一每细胞的畸变数(畸变/细胞或每百个细胞的畸变数，%;D 吸收剂量，单位为戈瑞11
18、. 961，2/y不接近于1.00，2/y1. 00，为过离散分布。举例说明。例如某人受60Co y射线急性照射，照后38天检查染色体，共分析300个细胞，dic+r总数为GB/T 28236-20门134个，估算受照剂量为2.30(2. 072. 50)Gy，检查是否为均匀照射。本例n=300，xo=134，y=134/300=0. 446 7 dic+r分布:dic十r/细胞。l 细胞数200 73 2 3 4 21 5 1 2 = 2:X - (2:0)2 2:x。一一一一一一n n一l5 。一(口川OO叫2X7川2X2川2X川2X1一-j300 u= 158. 146 7 严nn 29
19、9 .-. . 172旦些2二1.184 0 y v.v. (n- l).u2 一一(n-1) 300-1 299 X 1. 184 0 -29 = 2.258 2 2(n-川一支)2 X 299 (1- 1;4) u1. 96，2 /y1. 00，不服从泊松分布，为过离散分布，故此人受到的是不均匀照射。B.2.2 局部照射或不均匀照射时的受照份额和剂量估算:在局部或高度不均匀照射时，用染色体畸变分析只能给出全身等效剂量，这种剂量表达方式很不确切。为此，IAEA(l986)介绍用不纯泊松分布方法及品质值(Qdr)方法估计局部(或不均匀)照射时的受照份额及其相应剂量。B. 2. 2.1 不纯泊松
20、分布法在局部照射条件下，dic(或dic十r)在细胞间的分布是受照部分的泊松分布与未受照射部分分布的叠加，由于未照射部分含有的畸变可以忽略，该分布与正常泊松分布相比，正常细胞所占份额相对增加，分布过于离散，利用该特性，采用最大似然估计数学方法估计受照细胞的份额:式中zf 受照份额;n一一观察细胞数;n。一一不含有dic的细胞数;z一-dic总数;y一一受照淋巴细胞的平均畸变率。.( B.5 ) y/寸，/=主.( B.6 ) 根据公式。.5)求出y，将其代人剂量效应曲线求出受照剂量。考虑到细胞的间期死亡和有丝分裂延迟效应，/值尚须修正才能求出受照的实际份额。12 f F=F 1-/+言:Q =
21、eDo f =I! F = _e_D.;_o _ 一1-/+芒百e Da .( B.7 ) GB/T 28236-2011 式中zF一一实际受照份额; 达到中期分裂相的细胞与受照细胞总数之比值;D一剂量;趴在一次击中造成细胞死亡的情况下，使活存细胞由100%减少到37%所需要的剂量。此时Do=D37 ，而对多靶子细胞D37=Do + Dq ，Do或D37可根据实验得出。下面引用IAEA所举病例。某人受到6.7CP叮r非均匀照射，伴有局部烧伤，计数1000个中期分裂相，有99个含非稳定畸变的细胞，dic86个，r2个和60个多余元着丝粒畸变，双着丝粒体分布为:Dic/细胞o 1 细胞数932 5
22、6 剂量效应曲线为:Y(双)= 1. 57 X 10-4 D+5. 0 X 10-6 D2 Y(元)=2.30 X 10-4 D+3. 9 X 10-6 D2 用最大似然估计dic产额2 9 3 1 4 1 5 1 节86一乙二_，UU , y=0.489 1 - e-Y 1 000 - 932 将其代人方程，D=297cGyo f z86 =一一一_UV_=0.176 n y 1 000 X O. 489 Do =270 cGy，p=e-D1Do二e-297/270=e-1. 1 =0.33 1 0.176 F=一一一巳一r二0.33 _=0.393 t _ 1 , O. 176 1-1+干
23、l一0.176+一一0.33 此人身体受照份额约40%，平均剂量约300cGyo B. 2. 2. 2 Qdr法该方法考虑dic+r在非稳定性畸变的M1细胞中的出现频率，以此作为品质值，用符号Qdr表示。假设总的非稳定性畸变在受照细胞间呈泊松分布，dic+r率为Yl总畸变率为Y2，总畸变细胞数为凡，总的dic+r数为X，QJr=Z Y1、(B. 8 ) 几1-exp(-Yl一如)仍举上例，x=86，n.=99Yl =1. 57 X 1O-4D+5. 0 X 10-6D2 Y2 =2.30 X 1O-4D+3. 9 X 1O-6D2 各项分别代入上式r一旦旦1.57X 10-4D+ 5.0 X
24、10-6 D2 -99 -1-exp(-3. 87 X 10-4D - 8. 9 X 10-6 D2) 用迭代法求解，D=319cGy，与不纯泊松分布法求得D为297cGy相一致。上述两种方法都以分布的特征假设为前提，Qdr法以总畸变分布服从泊松分布为前提，一般情况，这个假设不能得到满足，因而应用此法会带来系统误差。这两种方法都只适用于低LET辐射的急性照射条件下的局部照射剂量估计，还必须具有含两个或两个以上dic+r的细胞时方可应用这两种方法。总之，局部照射剂量估算，较为多见，受到学者们的广泛重视，也取得一定进展，但尚需不断完善。13 FFON-cmNNH阁。华人民共和国家标准染色体畸变估算
25、生物剂量方法GB/T 28236-2011 国白 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷印张1.25 字数26千字2012年4月第一次印刷开本880X12301/16 2012年4月第一版晤书号:155066. 1-44860 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28236-2011 打印日期:2012年5月22日F002
