1、中华人民共和国国家标准GB 15193. 6-94 骨髓细胞染色体畸班试验Chro刷刷刷刷aberrationtest of bone marrow 臼II1 ；！；：题内容与适用范阻本标准王军运动物f辛苦章染色体哥哥交试验的基本技术姿求。本标准适用于检测i环境有害物质对大、小鼠骨髓细胞的遗传莓陵。2 原琅染色体是续稳核中类有特殊续稳幸在遗传功能去包小体，当化学物旗作怒于绍跑翅骂骂G，豁幸us嫁时，诱发染色体型畸变，而作用于G，期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大、小商鼠腹腔注入秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锥体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体纹缩短、分散，轮廓清晰。夜显微镜下观
2、察染色体数目和形态，3 t武钢1:部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸铺水。3.1 0.1%秋水仙索fl于棕色瓶中，冰箱保存。3.2 2.2%拧核酸锅。3.3 pH7.4磷酸缓：中液。3. 3. 1 1/15 mol/l磷酸氢二锅溶液g磷酸氢二锅（Na，日P0,)9.47 g溶子1000 rnL蒸馆水中。3. 3. 2 1/15 mol/l，磷酸二氢绑溶液g磷酸二氢绑（KH,PO，49.07自溶于1000 ml.蒸馆水中。3.3.3 将磷酸氢二纳溶液80时，与磷酸二氧仰溶液20mL混合，用pH计测定并调节pH至7.4 0 3.4 号.075 mol/L氯化铸溶液。3. 5 甲醇分析纯）冰乙酸
3、分析纯以3 1混合，将用现自己。3. 6 Gien1sa溶液。3. 6. 1 Giemsa储备液：取吉姆萨染料3.8 g，置玛瑜乳钵中，加少最甲醇研磨，逐渐加甲醇至375mL, 溶解后再加125ml，纯甘池，于37滋箱保温48杠，夜此期间摇动数次，放置12蹲过滤备用。3. 6. 2 Gi自msati.Y喜液z滚1mL储备液加入10ml. pH7. 4磷酸缓冲液。4 仪器与设备4. 1 实验室常用设备。4.2 ？草草草水浴锅37土5，4.3离心机。4.4 生物显微镜。中华人民共和国卫生部1994-0810批准562 199408-10实施GB 15193. 6 94 5操作步骤5. 1 动物处理
4、5. 1. 1 取健康成年大、小鼠。5. 1. 2 按LDso的1/4、1/8、1/16，也可用最大耐受剂量为最高剂量，下设兰个剂量，经口给予受试物24次，每次间隔24h，在末次给受试物后1824h取材。另设阴性对照组（溶剂对照及阳性对Jffl组。每组两个性别的动物数各不少于5只。必要时可先用个剂量的3只动物，于给受试物后6,24,48h分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用15只动物，于6,24.48h后分别各处死5只动物取材。5. 2 取材5.2. 1 处死动物前24h，按4mg/kg体重腹腔注入秋水仙素。5.2.2大鼠断头处死、小鼠颈椎脱臼。5.2.
5、3 取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨畴，用带针头的注射桥吸取Z4mL2. 2%拧橡酸销溶液，将骨髓洗入10mL离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以1000 1 500 r/min离心10 min，弃去上清液。5.3 低渗处理离心后的沉淀物加入4mL O. 075 mol/L氯化饵溶液，混匀后在37水浴或恒温箱中放置1020min，再以1000 1 500 r/min离心，弃去上清液。5. 4 固定将新配制甲醇冰乙酸固定液4mL沿管壁加入样品中，1015min后，用吸管将细胞回块打碎继续固定1015min，以1000 r/min离心10min奔去上清液，再加固定液4mL静置20
6、min后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成0.5 1. 0 mL细胞悬液。5. 5制片5. 5. 1 先将洗净的载玻片保存于冰水中备用。5. 5. 2 白冰水中取出载玻片，倾斜30。放置，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3处滴3滴，轻吹细胞悬液扩散平铺子玻片上。每个样品制23张玻片，空气中自然干燥。5.6染片I陆用时取Giemsa储备液1mL加磷酸缓冲液10mL，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色15min 左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。5. 7镜检5. 7. 1 在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置
7、、染色体呈红紫色。5. 7. 2 用油镜进行细胞中期染色体分析。5. 8观察项目和结果判定5. s. 1 每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个中期相细胞。观察项目为染色体数目和结构改变，统计学处理用X检验。5.8.2 染色体数目的改变5.8.2. 1 非整倍体z亚二倍体或超二倍体。5. s. 2. 2 .多倍体z染色体成倍增加。5.8.3 内复制：包膜内的特殊形式的多倍化现象。5. 8.4 染色体结构的改变。5.8.4.1 断裂z损伤长度大于染色体的宽度。5. 8. 4. 2 微小体号较断片小而呈圆形。,63 GB15193.694 5.8.4-3 有着丝点环z带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。5.8.4.4 元着丝点环成环状结构。5. a. 4. 5 单体互换：形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。5.8.4-6 双微小体z成对的染色质小体。5.8.4. 7 裂隙z损伤的长度小于染色单体的宽度。5.8.4.8非特定性型变化如粉碎化、着丝点细长化、粘着等。附加说明：本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、哈尔滨医科大学、杭州市卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人韩驰、唐玲光、袁振华。本标准由E生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。. . 561
