1、UDC 576 316.087 F 73 华色共GB/T 12715 91 变Chromosomal aberration analysis for biological dose assessment 1991-01-28发布1992-0个01实施国技术监督局发布 -，- - 中华人民共和家准色体变分析估计生剂GB/T 12715-91 Cbromosomal aberration analysis for biological dose assessment 本标准规定了受电离辐射照射入员外周血淋巴细胞的细胞培养、染色体标本制备、染色体畸变分析及剂量估算方法。本标准适用于受过量外照射人员的
2、生物剂量估计。2 术语2. 1 过量照射工作人员受到大于国家标准推荐的相应剂量当量限值的照射。在本标准中指应急或事故情况下，超过100mSv的照射。2.2 持续照射一般地指持续时间较长的照射，在本标准中，则指由于照射时间较长，需要对剂量效应加以修正的照射。2.3染色体遗传基因的载体，存在于细胞内的线形结构，由脱氧核糖核酸(DNA)蛋白质和少量核糖核酸(RNA)等组成。在细胞分裂的中期变粗，其形态最为清晰，便于识别。每个中期染色体都含有两条染色单体。2.4 染色体畸变正常染色体在物理(如电离辐射或化学等因素作用下发生的结构和数量上的异常。2.5 生物剂量计用以估计受照剂量的生物体系，这生物体系受
3、到照射后的反应与受照剂量之间存在着某种定量关系，从而可用来估算受照的剂量。3 细胞培养与染色体畸变分析方法3. 1 材料3. 1. 1 试剂综合培养基(EagasMEM ,TC-199 ，RPMI-1640等)小牛或胎牛血清肝素纳5-澳脱氧尿喀院核昔33258 Hoechst 秋水仙素或甲基秋水就胶青霉素(医用)链霉素(医用)1991-01-28批准1992-01-01实施础冉lGB/T 12715-91 Giemsa染料甲醇A.R 冰醋酸A.RA.R 元离子水玻璃器皿洗涤剂3. 1. 2器皿培养瓶(lO15 rnL) 注射器(各种容量)注射针头(各种规格)试剂瓶(各种容量)刻度离心管10mL
4、 吸管和橡皮头载玻片精密pH试纸(6. 08. 4) 3. 1. 3设备冰箱(最好也有-20.C的低温冰箱)恒温培养箱(最好带控温仪)高压消毒锅烘箱恒温水浴锅离心机(甩平式)药物天平(感量。.001g) 紫外线灯或黑光灯(20 W) 台秤(最大称量1000 g) 双筒生物显微镜(带显微照相装置接种箱或超净工作台3. 2 淋巴细胞培养3. 2. 1 培养液配制(目镜7X或10X，物镜10X和100X油镜3.2.1.1 按选用的培养基说明要求，用灭菌无离子水溶解至工作液的浓度。3.2.1.2 将血清加入至上述稀释的培养液中，占培养液总量的12.5%25%。3.2.1.3 按规定将PHA用消毒的生理
5、盐水溶解成工作液，加入至上述培养液中，加入量按使用说明或每100mL培养液加入相当于25rng莱豆的PHA提取液。3. 2. 1.4 加入相当于培养液总体积O.5%0. 8%的肝素工作液(500IU/mL)。3.2.1.5 于上述培养液中加入抗生素溶液，其最终浓度为:青霉素100IU/mL.链霉素100吨/mL。3. 2. 1. 6 用5.5%的Na2HC03溶液调节培养基的pH，可在7.07.3之间，以7.2为宜。3.2.1.7 将上述培养液充分混匀后，即分装至每个培养瓶中，每瓶加入配制好的培养液45mL培养瓶的容积、清洁度和无菌也十分重要。3.2.2 接种和培养3. 2. 2. 1 用肝素
6、溶液作抗凝剂，湿润灭菌注射器后，抽取静脉血0.7mL，于每培养瓶中加入0.3mL , 平行接种两瓶。3.2.2.2 对过量受照者，于照射后尽早取血，但不要超过30d，接种瓶数不少于3瓶。3. 2. 2. 3 为确保分析的细胞都为培养后第一次有丝分裂细胞，于每瓶培养物中加入5-澳脱氧尿1$晓2 v , GB/T 12715-91 核昔溶液，使最终浓度为15mol/mL，然后放入恒温培养箱中避光培养。在培养44h之后，加入适当浓度的秋水仙素液，使最终浓度为0.75mol/mL。此法为FPG染色法所必需。3. 2. 2. 4 可用此步骤代替3.2. 2. 3，即在加入血样后不加入5澳脱氧尿暗暗主核1
7、!溶液。将培养物移至3TC的恒温培养箱中培养24h后，加入适当浓度的秋水仙东浴液，使其取终浓度为o.50. 75mol/ mLo秋水仙素稀释溶液也可在开始培养时加入。3.2.3 注意事项3. 2. 3. , 在操作时，必须严格注意在无茵条件下进行。3. 2.3.2 将培养物移入恒温培养箱后培养4850h，注意避光并保持恒温箱内温度在37士0.5(;的范围内。3. 3 染色体标本和j备3. 3. 低渗3.3. 1. 用吸管将培养物轻轻吹散打匀，移至10mL声明度离心管中，离心(80010r/min，6 10 min) ，去掉上清液，留下11.5 mL培养物。3.3.2 加入预温至37(;的0.0
8、75mol的KCl溶液68mL，打匀后进行低渗.3. 3.1.3 将离心管放入37C的恒温水浴锅中停留20min，在18min时加入0.5-1mL固定液到各管中进行预固定，旋即轻轻吹散打匀后离心，去掉上清液。3.3.2 固定3. 3. 2. 1 加入新鲜配制的固定液(3: 1的甲醇与冰乙酸泪6mL，注意慢慢加入，轻轻打散细胞回块。直至20min后才离心，去上清液。3. 3. 2. 2 再加入固定液24mL，静置10min(中间用吸管轻轻吹打12次后，再离心去上清液，再加入0.2mL新鲜配制的固定液。3.3.3制片3.3. 3. 用作制片的载玻片，必须严格按规定小心处理干净，用双蒸水浸泡，冰箱中
9、保存(最好不超过一周)。3.3.3.2将余下0.2mL左右的培养物，轻轻充分打匀，吸0.1mL滴加在预冷的载玻片上。3. 3. 3.3 接着由片的一方向另一方轻轻吹气，即从片子底部用吸水纸将水吸干，将片在酒精灯火焰上掠过12次，置晾片架上，待其自干。3.3.3.4 重复和j片步骤，使离心管内培养物制片两张。3.4染色3.4.1 FPG染色法3. 4. 1. , 滴10滴Hoechst染液(0.5问/mLpH6. 8的磷酸缓冲液)于标本片上，并盖上盖玻片，将片放在紫外灯或黑光灯下照0.5h。3. 4. ,. 2 IJ、心移走盖玻片，用pH6.8的磷酸缓冲液仔细清洗。3. 4. ,. 3 放到60
10、(;的2XSSC洛液2030min，接着用蒸馆水冲洗。3.4. 1.4 用Giemsa染液染色，Giemsa原液量为pH6.8的磷酸缓冲液容积的5%10%，染3min以上。3.4.1.5 用缓冲液浸泡短时间，蒸馆水洗，气干后封片。3.4.2通常的Giemsa染色3.4.2.1 1份Giemsa原液与9份pH为7.07.2的磷酸缓冲液混匀。3.4.2.2 将片的正面朝下斜放在干净的玻璃板上，将染液沿片边加入，1530min后用自来水冲洗。3.4. 2. 3 再用蒸馅水冲洗，置晾片架上晾干，即可观查。3.5 显微镜下分析3.5.1 进行镜下分析的工作人员，必须受过较严格训练，并具有辐射细胞遗传学的
11、基本知识。3 叫一川岛句且一一讯，GB/T 12715-91 3.5.2 为尽量减少观察分析染色体畸变时判断标准的差异，应事先对工作人员进行训练，包括分析同一标本片的给定区域内的畸变类型及崎变数，并与他人结果互相对比，以达到J在士5%的差异范围为宜。3.5.3 标本片上标签的规格、内容和粘贴位置应规范化。3.5.4 分析片子时，应将片子标签始终放在镜台的同方向。看片时应从片的一端开始，按横向或纵向顺序移动，选择可供分析的中期分裂细胞进行分析计数。3. 5. 5 先在低倍镜F找出染色体长度适中、分散较好和极少重叠的中期细胞，再转泊镜进行分析和记录2N=46或46士1条染色体的中期细胞。3. 5.
12、6 一但看到畸变时，应经他人确认，并记录该畸变在显微镜上位置的坐标。4 估计剂量4. 1 电离辐射外照射的情况下，用染色体畸变分析作剂量估计的范围在O.15Gy间。4.2 各个实验室应建立各自的剂量效应标准曲线，注意都用上述相同的细胞培养和染色体分析方法。4.3应按本标准3所述要求，建立剂量效应标准曲线，要同时选用23名不吸烟的健康成年人血样进行离体照射，将其血样在照前、照射期间及照后(1.52 h)过程中，都应保持在3TC的温度中，然后将受照射血液漓加到装有培养液的瓶中进行培养。4.4 为使曲线的数学拟含有较优的适度和有更大可用性，从O.15Gy间，最好要用10个以上的不同剂量进行照射以建立
13、标准曲线。4.5 对低传能线密度(LET)的电离辐射，以双着丝粒畸变或以无着丝粒畸变为指标，其剂量效应关系，以拟合二次多项式为宜。Y=c+D十卢D或y=D十卢D2. . . ( 1 ) 式中，Y一-为某类染色体畸变的发生率，%; D一-照射剂量，Gy;C一-常数项，也为该类畸变本底值;一-为剂量平方项系数;一一一为弗j直线项系数。对高LET辐射，剂量效应关系大多数为直线模式zY=c+aD . . . .( 2 ) 式(2)中符号同式(1)。这样，可从检查到的畸变率估计出生物剂量值。4.6估计剂量时，要注意事故过量照射的射线种类、剂量分布均匀度、是一次全身均匀或局部照射还是迁延照射、取样时间及培
14、养条件。4.7 在估计剂量时，还应对受照者的情况有较详细调查，以除去其他因素对染色体畸变率的影响，如受照者在过量照射前半年内有无接受医疗照射;感染性疾病;近年来曾否接触有害物质(某些药物、病毒及有关化学品等订本人及家族有无遗传性疾病史等。4.8用染色体暗变分析法在估算全身受一次性均匀分布的贯穿性(X，Y射线和中子照射)的过量外照射较准确。对于不均匀照射，本法只能给出相当于)次全身均匀照射的等效剂量。对持续性外照射下的剂量估算，要引入一些因子，其准确性稍差。4.9为提高剂量估计的可信程度，应分析足够的细胞数以缩小可信区间，分析细胞数的多少，取决于受照剂量的高低(表1)。4 c=:卢严4自吨GB/
15、T 12715-91 表l分析细胞数对剂量值估计的95%可信限影响Gy 可信限估计剂量分析细胞数200 500 1 000 上限0.34 0.25 0.10 下限0.005 0.005 上限0.63 0.50 0.40 0.25 下限0.03 0.10 0.12 工限0.87 0.71 0.64 0.50 下限0.19 0.30 0.36 上限1. 35 1. 21 1.13 1. 00 下限0.69 O. 81 0.85 5 数据的记录、处理和保存5.1 数据记录的目的是为了对每一事例、相应片号及原始情况有详细记载，便于日后查找和整理。5.2 每个实验室应有工作日志、各自规格统的标记、片号及
16、原始记录纸、整理统计记录纸等。5.3 原始记录纸除对每个细胞有记录格外，还应包括标本号、受检者姓名、制样日期、观察日期、观察者、所用显微镜号及各种畸变小计栏等。5.4 记录畸变的文字和标记，应按国际染色体命名法书写，并应记下每一畸变在显微镜上的坐标位置。5.5 对每例所受剂量的生物剂量估计方法、原始记录、估计剂量结果等资料，需要编档长期保存，以备查证。5 牛、每也一一A1 Y GB/T 12715-91 附录A剂量估计中的实例(补充件A1. 1 设在Y射线照射离体血后，建立的剂量效应模式为:Y = 3.93 X 10-十8.16X 10 D 式中.D的单位为rad，Y的单位为畸变数/细胞。.
17、( A1 ) A1.2 事故受照者在受照后6h至32d之间被取血7次，每次分析300个中期细胞，各次双着丝粒畸变数分别为72、75、62、68、69、67和65，它们之间波动不大，取其平均值。A1.3 观察了2100个中期细胞，共478个双着丝粒染色体，代入式(Al)(Y=478/2100)，求得D=1. 44 Gy，即平均全身吸收剂量为1.44Gyo A 1.4 再按A4所述步骤，算出95%置信区间的上下限数值。A2 Y射线与中子对全身的急性混合照射的剂量估算步骤A2.1 设中子对射线的吸收剂量比值为2 3，中子为0.7MeV的裂变中子，射线为CoY射线，计数100个中期细胞有120个双着丝
18、粒，即每个细胞有1.2个双着丝粒。其剂量效应曲线分别为z0.7 MeV中子y = 0.0005十8.32 X 10-D . . . ( A2 ) 射线y= 0.0005十1.64 X lO-D + 4. 92 X 10-6D .( A3 ) 式中Y和D的单位同式(Al)。A2.2 因为是混合的射线和中子照射，故进行剂量估计时按下述步骤进行。表A1对射线和中子混合照射后进行剂量估算的步骤步骤A2.5步骤A2.3和A2.7步骤A2.4射线照后，中子剂量，Gy射线剂量.Gy双着丝粒/细胞1. 44 2.16 0.266 1. 12 1. 68 0.167 1. 24 1. 86 。.2011. 20
19、 1. 80 O. 189 . 214 . 82 0.194 1. 21 1.815 A2.3 每细胞1.2个双着丝粒相当于1.44 Gy的中子照射。A2.4 1. 44 GyX3/2=2.16 Gy Y射线A2.5 2.16 Gy Y射线相当于每细胞为0.266个双着丝粒畸变。A2.6 1. 2-0. 266=0. 934是由中子诱发的双着丝粒产额。6 步骤A2.6中子射线照后，双着丝桩/细胞0.934 1. 032 0.999 1. 011 1. 006 GB/T 12715-91 A2.7 每细胞O.934个双着丝粒相当于1.12 Gy的中子剂量(又回到步骤A2.3)。A2.8接着又按步
20、骤A2.4算出线剂量为1.68 Gy，如此反复下去多次，即可得到近似估计值，中子剂量为1.21 Gy , Y射线剂量为1.82 Gyo A2.9再按A4所述步骤算出95%置信区阔的上限和下限数值.也可用以下简法求得s对中子Yn = C + QnDn . . . . .( A4 ) 对Y射线y , =c +:，D， + p，IY，叫A5) 式中:Yn一一中子照射诱发染色体和畸变率;a一一直线模式中的一次项系数$D.-中子吸收剂量，Gy;如已知y，一一射线诱发染色体暗变率ga，一一直线项系数gp，一一平方项系数sJ，一一射线吸收剂量，Gy;式中，R一中子与Y射线的吸收剂量比筐。Dn=R. D,.
21、. . . (A6) 则y.十，= c + (Ra. + a,)D, + pD; . (A7 ) 解2次式求出队，而Dn=R-Dr故可求出D.oA3 A3.1 A3.2 在低LET射线持续照射时，剂量平方项的系数下降。此时，剂量平方项应引入一个依赖于时间的因子，l!PG函数，故公式可写为2Y = aD + G (X)D 式中，Y、D、卢均与正文中式(1)同。而G=圣CX- 1 + exp(- X) .( A8 ) (A9 ) X=t/T .0 . . . ( A10 ) t为照射持续时间，T为染色体断裂的平均存在时间(-2h)。A3.3设一人受照于工业照相的Y射源8h，观察了1000个中期细胞
22、，有100个双着丝粒畸变。按公式计算，相当于受1.26 Gy照射引入G(X),t/T=8/2=4 计算得G(X)=0.377代入式(A8)后，计算得剂量为1.92Gyo A3.4 采用G函数进行计算的条件为，照射时剂量率比较恒定，受照的剂量大于二次项系数与次项系数的比值，即为A镶卢/)。A4 剂量估计中的不确定性的计算方法用下例表示。7 _-_d，._一一一GB/T 12715-91 、染色单体型畸变B2 B2.1 末端缺失和中间缺失缺失发生在一条染色单体上，因而不是对称的，而是单一的碎片或在单体附近或距单体较远。B2.2 非染色质损伤此种损伤也称为裂隙，是在染色体的一条或两条单体上出现的不着
23、色或染色非常浅的小区段，其宽度小于染色单体的直径。B2.3单体等位缺失断位发生在两条染色单体的同一位置上。B2.4 非对称性互换此种互换在某种程度上与染色体型的双着丝粒畸变形成有些类似，断裂发生在两个染色体的单体上(图B的。 - , , , -A菌，aE帽晶a 、也匾，如三Je，; 1掬耐，- 啕pey7 叫胁-、-国|jt n . -、，、，画，中间缺失或称微小体(箭头指处)图B5司，图B4三着丝粒和双着丝粒染色体及三对伴随的断片(箭头指处)+ 予染色单体的非对称性互换图B6B2.5 对称性互换此种互换在某种程度上与染色体的相互易位畸变的形成有些相似，两个单一断片发生了交换(图B7)。10 GB/T 12715-91 图B7染色单体的对称性互换附加说明z本标准由中国核工业总公司提出。本标准由中国辐射防护研究院负责起草。本标准主要起草人邓忘诚。 11 二平平, -一芝在，啤，盈争气r，华人民共和国家标准染色体畸变分析估计生物剂量GB/T 12715-91 国中(京)新登字023号3陪中国标准出版社出版(北京复外三里河中国标准出版社北京印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售版权专有不得翻印晤开本880X1230 1116 印张1字数21000 1992年6月第版1992年6月第一次印刷印数1-2000当晤v书号，155066 1-8851 法190-20 标目
