1、GB 123881990 中华人民共和国国家标准 食物中维生素 A和维生素 E 的 测定方法 Method for determination of retinol and tocopherol in foods GB/T 123881990 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用高效液相色谱法测定食物中维生素A和维生素E。 本标准适用于食物中维生素A和维生素E的测定。 第一篇 高效液相色谱法 2 原理 样品中的维生素 A 及维生素 E 经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提 取至有机溶剂中。用高效液相色谱法 C 2n 反相柱将维生素 A 和维生素 E 分离，经 紫外检测器检测，并用内标法定量
2、测定。最小检出量分别为V A ：0.8ng，-B： 91.8ng：-E：36.6ng：-E：20.6ng。 3 试剂 实验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。 31 无水乙醚：不含有过氧化物。 311 过氧化物检查方法：用5mL乙醚加1mL 10%碘化钾溶液，振摇1min， 如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加 4 滴 0.5%淀粉液，水层呈蓝色。 该醚需处理后使用。 312 去除过氧化物的方法：熏蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许，弃 去10%蒸馏水和10%残留液。 32 无水乙醇：不得含有醛类物质。 321 检查方法：取2mL银氨溶液于试管中，加入少量乙醛，摇匀，再加入 10%氢氧化钠
3、溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。 322 脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。 将两者倾入 1L 乙醇中，振摇后，放置暗处两天（不时摇动，促进反应） ，经过 滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的 50mL。当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量 适当增加。 33 无水硫酸钠。 34 甲醇：重蒸后使用。 35 重蒸水：水中加少量高锰酸钾，临用前蒸馏。 36 10%抗坏血酸溶液（m/V） ：临用前配制。 37 1：1氢氧化钾溶液。 38 10%氢氧化钠溶液（m/V） 。 39 5%硝酸银溶液（m/V） 。 中华人民共和国卫生部19900319批准 199012
4、01实施 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 GB 123881990 310 银氨溶液：加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止， 再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。 311 维生素 A 标准液：视黄醇（纯度 85%）或视黄醇乙酸酯（纯度 90%）经 皂化处理后使用，用脱醛乙醇溶解维生素 A 标准品，使其浓度大约为 1mL 相当 于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。 312 维生素E标准液：-生育酚（纯度95%） ，-生育酚（纯度95%） ，- 生育酚（纯度 95%） 。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素 E 标
5、准品，使其浓度 大约为1mL相当于1mg。 临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准 确浓度。 313 内标溶液：称取苯并芘纯度 98%，用脱醛乙醇配制成每 1mL 相当 于10g苯并e芘的内标溶液。 314 pH114试纸。 4 仪器和设备 41 实验室常用设备。 42 高压液相色谱仪带紫外分光检测器。 43 旋转蒸发器。 44 高速离心机 441 小离心管：具塑料盖1.53.0mL塑料离心管（与高速离心机配套） 。 45 高纯氮气。 46 恒温水浴锅。 47 紫外分光光度计。 5 操作步骤 51 样品处理 511 皂化 称取110g样品（含维生素A约3g，维生素E各异构体约为40g
6、）于 皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加5mL10% 抗坏血酸，苯并e芘标准液 2.00mL，混匀。加 10mL1：1 氢氧化钾，混匀。于 沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。 512 提取 5121 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分23次洗皂化瓶， 洗液并入分液漏斗中。用约 100mL 乙醚分两次皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分 液漏斗中。如有残渣。可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻 振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。 513 洗涤 5131 用约 50mL 水洗分液漏斗中的乙醚层，用 pH 试纸检验直至水
7、层不 显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加） 。 514 浓缩 5 1 4 1 将乙醚提取液经过无水硫酸钠 （约5g） 滤入与旋转蒸发器配套250 300mL 球形蒸发瓶内，用约 10mL 乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠 3 次，并入蒸 发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于 65水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶 中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00mL乙 醇，充分混合，溶解提取物。 515 带乙醇液移入一小塑料离心管中（4.4.1） ，离心 5min（5 000rpm） 。 上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后， 中华人民共和国卫生
8、部19900319批准 19901201实施 GB 123881990 再用乙醇重新定容。并记下体积比。 52 标准曲线的制备 521 维生素A和维生素E标准浓度的标定方法 取维生素A和各维生素E标准若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分 别按给定被长测定各维生素的吸光值，用比吸光系数计算出该维生素的浓度。 测定条件如下表所示。 表1 标准 加入标准的量 S，L 比吸光系数 % 1 cm E 波长 ，nm 视黄醇 -生育酚 -生育酚 -生育酚 10.00 100.00 100.00 100.00 1 835 71 92.8 91.2 325 294 298 298 浓度计算： 3 1 1
9、0 00 . 3 100 1 = S E A X （1） 式中：X 1 其维生素浓度，g/mL； A维生素的平均紫外吸光值； S加入标准的量，L； E某种维生素1%比吸光系数； 3 10 00 . 3 S 标准液稀释倍数。 522 标准曲线的制备 本方法采用内标法定量。把一定量的维生素A、-生育酚、-生育酚、 -生育酚及内标苯并e芘液混合均匀。选择合适灵敏度；使上述物质的各峰高 约为江量程 70%，为高浓度点。高浓度的 2 1 为低浓度点（其内标苯并e芘的浓 度值不变） ，用此二种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图，维生素标 准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓
10、度为横 坐标绘制，或计算直线回归方程。如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内 标法进行定量。 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 GB 123881990 维生素A和维生素E色谱图 本方法不能将-E和-E分开，故-E峰中包含有-E峰。 53 高效液相色谱分析 531 色谱条件（推荐条件） 5311 预柱：nltrasphere ODS loum，4mm4.5cm。 5312 分析柱：nltrasphere ODS sum，4.5mm25cm。 5313 流动相：甲醇：水=98：2。混匀，于临用前脱气。 5314 紫外检测器波长：300nm。量程0.02。 5315
11、进样量：20L。 5316 流速：1.7mL/min。 54 样品分析 取样品浓缩液20L，待绘制出色谱图及色谱参数后，再进行定性和定量。 541 定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。 542 定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以 此值在标准曲线上查测其含量。或用回归方程求出其含量。 6 计算 1000 100 2 = V m c X （2） 式中：X 2 某种维生素的含量，mg/100g； c由标准曲线上查到某种维生素含量，g/mL； V样品浓缩定容体积，mL； m样品质量，g。 用微处理机二点内标法进行计算时，按其计算公式计算或由微机直接给出 结果。 7 结果的允许
12、差 同一实验室，同时测定或重复测定结果相对偏差绝对值10%。 第二篇 比 色 法 8 原理 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 GB 123881990 维生素 A 在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶 液中所含维生素 A 的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用 分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。 9 试剂 本实验用水均为蒸馏水。 91 无水硫酸钠：同3.3。 92 乙酸酐。 93 乙醚：同3.1。 94 无水乙醇：同3.2。 95 三氯甲烷：应不含分解物，否则会破坏维生素A。 951 检查方法 三氯甲烷不稳定，放置后易受空
13、气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时 可取少量三氯甲烷置试管中加水少许摇振，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸 银液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。 952 处理方法 试剂应先测验是否含有分解产物，如有，则应于分液漏斗中加水洗数次， 加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馏。 96 25%三氯化锑-三氯甲烷溶液，用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液，储于棕 色瓶中（注意勿使吸收水分） 。 97 1：1氢氧化钾溶液。 98 维生素A或视黄醇乙酸酯标准液：同3.11。其标定方法同5.2.1。 99 酚酞指示剂：用95%乙醇配制1%溶液。 10 仪器和设备 101 实验室常用设备。 102 分光光度
14、计。 103 回流冷凝装置。 11 操作步骤 维生素 A 极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪 器。 111 样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。 1111 皂化法：适用于维生素 A 含量不高的样品。可减少脂溶性物质的干 扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。 11111 皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取0.55g样品于三 角瓶中。加入 10mL1：1 氢氧化钾及 2040mL 乙醇，于电热板上回流 30min 至 皂化完全为止。 11112 提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶， 洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤
15、入分液漏斗内。用50mL乙醚 分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层 放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个 分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗 合并。重复至水液中无维生素A为止。 11113 洗涤：用约 30mL 水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片 刻后，放去水层。加1520mL0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后， 弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约 30mL，直至洗涤 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 GB 1238819
16、90 液与酚酞指示剂呈无色为止（大约 3 次） 。醚层液静置 1020min，小心放出析 出的水。 11114 浓缩：将层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约 25mL 乙醚 冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置冰浴上蒸馏，收回乙醚。 待瓶中剩约 5mL 乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷 使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。 1112 研磨法：适用于每克样品维生素 A 含量大于 510g 样品的测定， 如肝的分析。步骤简单，省时，结果准确。 11121 研磨：精确称 25g 样品，放入盛有 35 倍样品重量的无水硫 酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均
17、质化。 11122 提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入 50100mL 乙醚。紧压盖子，用力振摇 2min，使样品中维生素 A 溶于乙醚中。 使其自行澄清（大约需 12h） ，或离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时需在冷 水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先放入冷水浴中） 。 11123 浓缩：取澄清提取乙醚液 25mL，放入比色管中，在 7080 水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。 12 测定步骤 121 标准曲线的制备 准确取一定量的维生素 A 标准液于45个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准 系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管
18、加 入乙酸酐 1 滴，制成标准比色列。于 620nm 波长处，以三氯甲烷调节吸光度至 零点，将其标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑-三氯甲烷溶 液。于6s内测定吸光度，将吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标 准曲线图。 122 样品测定 于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入1滴乙酸酐为空白液。另一比色管 中加入 1mL 三氯甲烷，其余比色管中分别加入 1mL 样品溶液及 1 滴乙酸酐。其 余步骤同标准曲线的制备。 13 计算 1000 100 = V m c X （3） 式中：X样品中含维生素 A 的量：mg/100g（如按国际单位，每 1 国际单 位=0.3g维生素A） ； c由标准曲线上查得样品中含维生素A的含量，g/mL； m样品质量，g； V提取后加三氯甲烷定量之体积，mL； 100以每百克样品计。 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 GB 123881990 附加说明： 本标准由中华人民共和国卫生部卫生监督司提出，食品卫生标准分委员会 审查通过。 本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所起草。 本标准主要起草人王光亚、李晶。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施
