1、123911990 中华人民共和国国家标准 食物中核黄素的测定方法 Method for determination of riboflavin in foods GB/T 123911990 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用微生物法和荧光法测定食物中核黄素含量。 本标准适用于各类食物中核黄的测定。 第一篇 微生物法 2 原理 某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌 （Lactobacillus casei，简称 L.C. ）的生长需要核黄素；培养基中若缺乏这 种维生素该细菌；便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况。以及它的代谢 物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成
2、正比， 因此可以用酸度及混浊度的测定 法来测定样品中核黄素的含量。 3 试剂 本实验用水均需蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。 31 冰乙酸。 32 甲苯。 33 无水乙酸钠。 34 乙酸铅。 35 氢氧化铵。 36 干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei ATCC 7489） 。 37 盐酸：0.1 mol/L。 38 氢氧化钠：1 mol/L和0.1 mol/L。 39 0.9%氯化钠溶液（生理盐水） ：使用前应进行灭菌处理。 310 核黄素标准储备液（25 ug/mL） ：将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥 器或盛有硫酸的干燥器中。经过24 h 后。准确称取50 mg，置于2 L
3、容量瓶中， 加入 2.4 mL 冰乙酸和 1.5 L 水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室 温，稀释至2 L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。 311 核黄素标准中间液（10 ug/mL）,准确吸取 20 mL 核黄素标准储备液，加 水稀释至50 mL。 312 核黄素标准中间液（0.1 ug/mL） ，准确吸取 1.0 mL 中间液于 100 mL 容 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次分析要配制新标准使用液。 313 碱处理蛋白胨：分别称取40 g蛋白胨和 20 g氢氧化钠于250 mL水中。 混合后，放于370.5恒温箱内，2448 h后取出，用冰乙酸调节pH
4、至6.8， 加 14 g 无水乙酸钠（或 23.28 含有 3 分子结晶水的乙酸钠） ，稀释至 800 mL， 加少许甲苯盛于溶液表面，于冰箱中保存。 314 0.1%胱氨酸溶液：称取1 gL胱氨酸于小烧杯中。加20 mL 水，缓慢加 入经约 510 mL 盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至 1 L，加少许甲苯盖于溶 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 123911990 液表面。 315 酵母补充液：称取 100 g 酵母提取物干粉于 500 mL 水中、称取 150 g 乙酸铅于500 mL水中。将两
5、溶液混合，以氢氧化铵调节pH至酚酞量红色（取少 许溶液检验） 。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节pH至5.5。通入硫化 氢直至不生沉淀。过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖 于溶液表面，于冰箱中保存。 316 甲盐溶液：称取 25 g 磷酸氢二钾和 25 g 磷酸二氢钾，加水溶解，并稀 释至500 mL。加放少许甲苯以保存之。 317 乙盐溶液：称取10 g硫酸镁（MgSO 4 7 H 2 ） ，0.5 g硫酸亚铁（FeSO 4 7 H 2 O） 和0.5 g硫酸锰（MnSO 4 4H 2 O） ，加水溶解，并稀释至500 mL，加少许甲苯以保 存之。 318 基本培养
6、储备液：将下列试剂混合于 500 mL 烧杯中，加水至 450 mL， 用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，用水稀释至500 mL。 碱处理蛋白胨 100 mL 0.1%胱氨酸溶液 100 mL 酵母补充液 20 mL 甲盐溶液 10 mL 乙盐溶液 10 mL 无水葡萄糖 10 g 319 琼脂培养基：将下列试剂混合于 250 mL 三角瓶中，加水至 100 mL，于 水浴上煮至琼脂完全溶化，用 1 mol/L 盐酸趁热调节 pH 至 6.8。尽快倒入试管 中，每管35 mL，塞上棉塞，于高压锅内在5.910 4 Pa（10 lb/in 2 ）压力下灭 菌15 min，取出后直立试
7、管，冷至室温，于冰箱中保存。 无水葡萄糖 1 g 乙酸钠（NaAc3H 2 O） 1.7 g 蛋白胨 0.8 g 酵母提取物干粉 0.2 g 甲盐溶液 0.2 mL 乙盐溶液 0.2 mL 琼脂 1.2 g 320 0.04%溴甲酚绿指示剂：称取0.1 g 溴甲酚绿于小研钵中，加1.4 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研钵磨。用水稀释至250 mL。 321 0.04%溴麝香草酚蓝指示剂：称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于小研钵中，加 1.6 mL和0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解， 用水稀释至250 mL。 4 仪器与设备 41 实
8、验室常用设备。 42 电热恒温培养箱。 43 离心沉淀机。 44 液体快速混合器。 45 离压消毒锅。 5 菌种的制备与保存 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 123911990 51 储备菌种的制备：以 LC纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在 370.5恒温培养箱中保温1624 h。贮于冰箱内，至多不超过2 周，最好每 周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使 用前每天移种一次，连续23 d方可使用，否则生长不好。 52 种子培养液的制备：取5 mL核黄素标准使用液和5 mL基本培养储备液于 15 mL 离心管混匀，塞上棉塞
9、，于高压锅内在6.910 4 Pa（10 lb/in 2 ）压力下灭 菌15 min。每次可制备24管。 6 操作步骤 因核黄素易被日光和紫外线破坏，故一切操作要在暗室内进行。 61 接种液的制备：使用前一天，将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培 养液中，同时制作二管。在370.5保温1624 h。取出后离心10 min（3000 rpm） ， 以无菌操作方法倾去上部液体， 用已消毒的生理盐水淋洗二次， 再加10 mL 消毒生理盐水，在液体快速混合器上振摇试管，使菌种成混悬体。将此液倾入已 消毒的注射器内，立即使用。 62 样品的制备 621 将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。
10、 622 称取约含510 ug的核黄素样品（谷类约10 g，干豆类约 4 g，肉类 约5 g） ，加入50 mL0.1 mol/L 盐酸溶液，混匀。置于高压锅内，在10.310 4 Pa （15 lb/in 2 ）压力下水解30 min。 623 冷至室温，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节至4.6(取少许水解液，用溴 甲酚绿检验，溶液呈草绿色即可)。 624 加入淀粉酶或木瓜蛋白酶，每克样品加入20 mg酶。在40恒温箱中 过夜，大约16 h。 625 冷至室温，加水稀释到100 mL：过滤。对于脂肪量高的食物，可用乙 醚提取，以除去脂肪。 63 标准管的制备 两组试管中管各加核黄素标准使用液
11、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，每管加水至5 mL，再每管加5 mL基本培养储备液混匀。 64 样品 的制备 641 吸取样品溶液510 mL，置于25 mL具塞试管中，用0.1 mol/L氢氧 化钠调节pH至6.8（取少许溶液，用溴麝香草酚蓝检验） ，加水稀释至刻度。 642 取两组试管，各加（6.4.1）样品稀释液1、2、3、4 mL，每管加水至 5 mL，每管再加5 mL基本培养储备液混匀。 6 5 灭菌： 将以上样品管和标准管全部塞上棉塞， 置于高压锅内， 在6.910 4 Pa （10 lb/in 2 ）压力下灭菌15 min。 66 接种和培养 661
12、 待试管冷至室温，在无菌操作条件下接种，每管加一滴接种液（6.1） ， 接种时注射器针头不要碰试客壁，要使接种液直接滴在培养液内。 662 置于 370.5恒温箱中培养约 72 h，培养时每管必须在同一温度。 培养时间可延长 18 h或减少12 h。必要时可在冰箱内保存一夜再滴定。若用混 浊度测定法：以培养1824 h为宜。 67 滴定 将试管中培养液倒入 50 mL 三角瓶中，加 0.001%溴麝香草酚蓝溶液 5 mL， 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 123911990 分二次淋洗试管，洗液倒至该三角瓶中，以0.1 mol/L 氢氧化钠溶液滴定，终点 呈绿色
13、。以第一瓶的滴定终点作为变色参照瓶。约 30 min 后再换一参照瓶，因 溶液放置过久颜色变浅。 68 用标准核黄素溶液的不同浓度为横坐标及在滴定时所需 0.1 mol/L氢氧化 钠的毫升数为纵坐标。绘制标准曲线。 69 计算 1000 100 1 = F m V c X （1） 式中：X 1 样品中核黄素含量，mg/100g； c以曲线查得每毫升试样中核黄素含量，ug/mL； V样品水解液定容总体积，mL； F试样液的稀释倍数； m试样质量，g； 1000 100 样品含量由ug/g换算成mg/100 g的系数。 7 结果的允许误差 同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值10%。 第
14、二篇 荧 光 法 8 原理 核黄素在440500 nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强 度与核黄素的浓度成正比。在波长 525 nm 下测定其荧光强度。试液再加入低亚 硫酸钠（Na 2 S 2 O 4 ） ，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光 杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。 9 试剂 试验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。 91 硅镁吸附剂：60100目。 92 2.5 mol/L无水乙酸钠溶液。 93 10%木瓜蛋白酶：用2.5 mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。 94 10%淀粉酶；用2.5 mol/L乙酸钠溶液配制。使用
15、时现配制。 95 0.1 mol/L盐酸：同3.7。 96 1 mol/L盐酸：同3.8。 97 0.1 mol/L氢氧化钠：同3.8。 98 20%低亚硫酸钠溶液：此液用时现配。保存在冰水浴中，4 h内有效。 99 洗脱液：丙酮：冰乙酸：水（5：2：9） 。 910 0.04%溴甲酚绿指示剂：同3.20。 911 3%高锰酸钾溶液。 912 3%过氧化氢溶液。 913 核黄素标准液的配制（纯度98%） 。 9131 核黄素标准储备液（25 ug/mL） ：同3.10。 9132 核黄素标准使用液：吸取 2.00 mL 核黄素标准储备液，置于 50 mL 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮
16、于4冰箱，可保存一周。此溶液每 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 123911990 毫升相当于1.00 ug核黄素。 10 仪器与设备 101 实验室常用设备。 102 高压消毒锅。 103 电热恒温培养箱。 104 核黄素吸附柱：见图。 105 荧光分光光度计 11 操作步骤 整个操作过程需避光进行。 111 样品提取 1111 水分 称取 210 g 样品（约含 10200 ug 核黄素）于 100 mL 三角瓶中，加入 50 mL0.1 mol/L盐酸，搅拌直到颗粒分散均匀。用40 mL 瓷坩埚为盖扣住瓶口， 置于高压锅内高压水解，10.310 4 Pa（
17、15lb/in 2 ）30 min。水解液冷却后，滴加 1 mol/L氢氧化钠，取少许水解液，用0.04%溴甲酚绿检验呈草绿色，pH 为4.5。 1112 酶解 11121 含有淀粉的水解液：加入 3 mL10%淀粉酶溶液，于 3740保温 约16 h。 11122 含高蛋白的水解液：加 3 mL10%木瓜蛋白酶溶液，于 3740保 温约16 h。 1113 过滤 上述酶解液定容至100.0 mL，用干滤纸过滤。此提取液在4冰箱中可保存 一周。 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施 123911990 112 氧化去杂质 11 2 1 视样品中黄素的含量取一定体积的样
18、品提取液及核黄素标准使用液 （约 含 110 ug 核黄素）分别于 20 mL 的带盖刻度试管中，加水至 15 mL。各管加 0.5 mL 冰乙酸，混匀。加 3%高锰酸钾溶液 0.5 mL，混匀，放置 2 min，使氧化 去杂质。滴加 3%双氧水溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色褪掉。剧烈振摇此管， 使多余的氧化逸出。 113 核黄素的吸附和洗脱 1131 核黄素吸附柱：硅镁吸附剂约1 g用湿法装入柱，占柱长1/22。3 （约 5 cm）为宜（吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上） ，勿使柱内产生气泡，调节 流速约为60滴/min。 1132 过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用约20 m
19、L 热水洗去样液中的杂质。然后用 5.00 mL 洗脱液（9.9）将样品中核横素洗脱并 收集于一带盖 10 mL 刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液体并定容至 10 mL，混匀后待测荧光。 114 测定 1141 于激发光波长 440 nm，发射光波长 525 nm，测量样品管及标准管的 荧光值。 1142 待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液（约57 mL）中加 0.1 mL20%低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20 s 内测出各管的荧光值，作为各自 的空白值。 115 计算 () () 1000 100 2 = f m D C S B A X 式中：X 2 样品中含核黄不比的量，mg/100 g； A样品管荧光值； B样品管空白荧光值； C标准管荧光值； D标准管空白荧光值； f稀释倍数； m样品的质量，g； S标准管中核黄素量由ug； 1000 100 将样品中核黄素量由ug/g折算成ug/100 g的折算系数。 附加说明： 本标准由中华人民共和国卫生部卫生监督司提出， 食品卫生标准分委员会审 查通过。 本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所起草。 本标准主要起草人王光亚、曲宁、李晶。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国卫生部19900319批准 19901201实施
