1、 中华人民共和国国家标准 食物中烟酸的测定方法 GB/T 12395 90 Method for determination of niacin in foods 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用微生物方法测定食物中的烟酸含量。 本标准适用于各类食物中烟酸的测定。 2 原理 某一种微生物的生长, 必需某些维生素, 例如 L.arabinosus17-5 之生长需要烟酸, 培 养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下, 该细菌生长的情况, 以及它 的代谢物乳酸的浓度是与培养基中该维生素含量成正比的, 因此可以用酸度或浑浊度的测 定法来测定样品中烟酸的含量。本方法检出限为 10n
2、g。 3 试剂 本实验所用之水均需蒸馏水。所用试剂均需分析纯。 3.1 甲苯。 3.2 盐酸: 3mol/L 溶液。 3.3 盐酸: 1:5(V/V)溶液。 3.4 硫酸: 0.5mol/L 溶液。于 2000mL 的烧杯中先注入 700mL 水 ,将 28mL 硫酸沿烧杯壁慢慢 倒入水中, 用水稀释至 1000ml。 3.5 冰乙酸: 0.02mol/L 溶液。 3.6 氢氧化钠: 40 溶液。溶 200g 氢氧化钠于水中, 稀释至 500mL。 3.7 氢氧化钠: 0.1mol/L 溶液。溶 4g 氢氧化钠于水中, 稀释至 1000mL。 3.8 乙醇: 25 (V/V)溶液。 3.9 酪
3、蛋白: 不含维生素。 3.9.1 不含维生素酪蛋白的制备 3.9.1.1 乙醇处理法: 称取 100g 酪蛋白细粉于烧瓶中, 加入 300mL95乙醇, 在水浴中加 热回流 1h,减压抽滤, 弃去滤液, 再加入乙醇回流, 如此反复 3 4 次 ,至滤液呈微黄色或 无色, 取出在烘箱内 70 80干燥即可。 3.9.1.2 酸洗法: 称取 250g 酪蛋白, 置于 5L 容器中, 慢慢加入 3.6L 水以防止成块, 加入浓 盐酸 2.77mL,搅拌浸泡 3min。用虹吸管除去上层清液。加入 3.6L 水 ,再加入浓盐酸 2.77mL, 如此反复 8 次后, 再加水 3.6L,加入 55.5mL1
4、2mol/L 氨水, 放置过夜, 使酪蛋白溶解成浆状。 用布过滤, 于滤液中慢慢加入约 50mL3mol/L 盐酸, 调至 pH4.5,使酪蛋白全部沉淀, 过滤。 弃去滤液, 用 50 60热水冲洗数次, 挤压去水, 放入烤箱内于 100烤干即可。 3.10 酸解酪蛋白 : 称取 50g 不含维生素的酪蛋白于 500mL 烧杯中 ,加 200mL3mol/L 盐酸 ,于 压力蒸汽消毒器内 10.3 14*4Pa(151b/in*2)压力下水解 6h。将水解物转移至蒸发皿内, 在沸水浴上蒸发至膏状。加 200mL 水使之溶解后再蒸发至膏状, 如此反复 3 次, 以除去盐酸。 注意每次蒸发时不可蒸
5、干或使之焦糊, 因为蒸到这样程度, 水解液所含营养物已被破坏。 用 40氢氧化钠调节 pH 至 3.5,以溴酚蓝作外指示剂。加 20g 活性炭, 振摇, 过滤。如果滤 液不呈淡黄色或无色, 可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至 500mL,加少许甲苯于冰箱中 保存。 3.11 胱氨酸、色氨酸溶液 : 称取 4gL-胱氨酸和 1gL-色氨酸( 或 2gDL-色氨酸 )于 800mL 水中 , 加热至 70 80 ,逐滴加入 1:5(V/V)盐酸, 不断搅拌, 直至完全溶解为止。冷至室温, 加 水稀释至 1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存。 3.12 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液: 称取硫酸腺嘌呤(
6、 纯度为 98 )、盐酸鸟嘌呤( 生化 试剂) 以及尿嘧啶各 0.1g 于 250mL 烧杯中 ,加 75mL 水和 2mL 浓盐酸, 然后加热使其完全溶解 , 冷却, 若有沉淀产生, 加盐酸数滴, 再加热, 如此反复, 直至冷却后无沉淀产生为止, 以水稀 释至 100mL。加少许甲苯于冰箱中保存。 3.13 D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液: 称取 D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐 酸吡哆醇各 10mg 于烧杯中, 以水溶解并稀释至 1000mL,将此液置于棕色试剂瓶中, 加少许甲 苯于冰箱中保存。 3.14 核黄素、 盐酸硫胺素、生物素溶液 : 溶解 1mg 生物素结晶于 100mL0
7、.02mol/L 乙酸中, 取此液 4mL(相当于 40g 生物素 )于 2000mL 烧杯中, 加入 20mg 核黄素和 10mg 盐酸硫胺素 ,以 0.02mol/L 乙酸溶解并稀释至 1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存, 此试剂需保存于棕色瓶 中 ,以防止核黄素被光破坏。 3.15 甲盐溶液 : 称取 25g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 和 25g 磷酸二氢钾(KH2PO4), 加水溶解后稀 释至 500ml,加少许甲苯以保存之。 3.16 乙盐溶液 : 称取 10g 硫酸镁 (MgSO4 7H2O)、 0.5g 氯化钠、0.5g 硫酸亚铁(FeSO4 7H2O) 和 0.5g 硫酸锰
8、(MnSO4 H2O),加水溶解后稀释至 500mL,加 5 滴盐酸 ,加少许甲苯以保存之。 3.17 烟酸标准储备液(0.1mg/mL): 准确称取 50mg 已干燥恒重并贮于五氧化二磷干燥器中 的烟酸标准品, 以 25乙醇溶液溶解并定容至 500mL,混匀, 于冰箱中保存。此溶液每毫升 相当于 100 g 烟酸。 3.18 烟酸标准中间液(1 g/mL): 吸取 1.00mL 烟酸标准储备液, 置于 100mL 容量瓶中, 用 25乙醇溶液定容, 混匀, 于冰箱中保存。此溶液每毫升相当于 1 g 烟酸。 3.19 烟酸标准使用液(0.1 g/mL): 临用时吸取 5.00mL 烟酸标准中间
9、液, 置于 50mL 容量 瓶中, 用水定容, 混匀。此溶液每毫升相当于 0.1 g 烟酸。 3.20 基本培养基储备液: 将下列试剂混合于 500mL 烧杯中, 加水至 450mL,用 40氢氧化 钠溶液调节 pH 至 6.8,以溴麝香草酚蓝作外指示剂, 用水稀释至 500mL。 酸解酪蛋白 50mL 胱氨酸、色氨酸溶液 50mL 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 10mL D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、吡哆醇溶液 10mL 核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液 10mL 甲盐溶液 10mL 乙盐溶液 10mL 无水葡萄糖 10g 无水乙酸钠 10g (或结晶乙酸钠 NaAc 3H2O) (16.6g) 3
10、.21 琼脂培养基: 将下列试剂混合于 250mL 三角瓶中, 加水至 100mL,于水浴上煮至琼脂 完全溶化, 以溴麝香草酚蓝为外指示剂, 用 1mol/L 盐酸趁热调节 pH 至 6.8,尽快倒入试管中, 每管 3 5mL,塞好棉塞, 于压力蒸汽消毒器内 6.9 10*4Pa(10lb/in*2)压力下灭菌 15min。 取出后竖直试管, 待冷至室温于冰箱中保存。 无水葡萄糖 1.0g 乙酸钠(NaAc 3H2O) 1.7g 蛋白胨( 生化试剂) 0.8g 酵母提取物干粉( 生化试剂) 0.2g 甲盐溶液 0.2mL 乙盐溶液 0.2mL 琼脂( 细菌培养) 1.2g 3.22 生理盐水
11、: 称取 9.0g 氯化钠溶于 1000mL 水中。每次使用时分别倒入 6 8 支 10mL试 管中, 每支约加 10mL,塞好棉塞, 于压力蒸汽消毒器内 6.9 10*4Pa(10lb/in*2)压力下消 毒 15min,备用。 3.23 溴酚蓝: 0.1 乙醇溶液。称取 0.1g 溴酚蓝, 用乙醇溶解后, 再加乙醇稀释至 100mL。 3.24 溴麝香草酚蓝: 0.04 溶液。称取 0.1g 溴麝香草酚蓝于小研钵内, 加 1.6mL0.1mol/L 氢氧化钠研磨, 加少许水继续研磨, 直至完全溶解, 用水稀释至 250mL。 3.25 溴麝香草酚蓝: 0.001 溶液。量取 25mL0.0
12、4溴麝香草酚蓝溶液, 加水稀释至 1000mL,供滴定用。 3.26 溴甲酚绿: 0.04 溶液。称取 0.1g 溴甲酚绿于小研钵中, 加 1.4mL0.1mol/L 氢氧化 钠研磨, 加少许水继续研磨, 直至完全溶解, 用水稀释至 250mL。 4 仪器和设备 4.1 实验室常用设备。 4.2 电热恒温培养箱。 4.3 压力蒸汽消毒器。 4.4 液体快速混合器。 4.5 离心机。 4.6 硬质玻璃试管: 20mm 150mm。 5 菌种与培养液的制备与保存 5.1 储备菌种的制备: 以阿拉伯乳酸杆菌 (Lactobacillus arabinosus 17-5 ATCC No. 8014,简
13、称 Lact.A.)纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中, 在 37 0.5恒温箱中保温 16 24h,取出于冰箱中保存, 不超过两周。保存数周以上的储备菌种, 不能立即用作制备接 种液之用, 必需在使用前每天移种一次, 连续 2 3d,方可使用, 否则生长不好。 5.2 种子培养液的制备: 加 5mL0.1 g/mL 烟酸标准使用液和 5mL 基本培养基储备液于一 15mL 离心管中, 塞好棉塞, 于 6.9 10*4Pa(10lb/in*2)压力下灭菌 15min,取出, 于冰箱 中保存。每次制备 2 4 管 ,备用。 6 操作步骤 6.1 接种液的制备 使用前一天, 将 Lact.A.
14、菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中。在 37 0.5 恒温箱中保温 16 24h,取出离心 10min(3000rpm),倾去上部液体, 用已灭菌的生理盐水 淋洗 2 次 ,再加 10mL 灭菌生理盐水, 将离心管置于液体快速混合器上混合, 使菌种成混悬体, 将此液倒入已灭菌的注射器内, 立即使用。 6.2 样品制备 称取含烟酸约 550 g 的均匀样品 ,置于 100mL 三角瓶中, 加 50mL0.5mol/L 硫酸 ,混匀 , 于 10.3 10*4Pa(15lb/in*2)压力下水解 30min,取出冷至室温, 用 40氢氧化钠溶液调 节 pH 至 4.5,以溴甲酚绿为外指示剂
15、。将水解液转移至 100mL 容量瓶中, 定容, 过滤。脂肪含 量高的样品, 用无水乙醚提取以除去脂肪。此样品水解液可在 4冰箱中保存数周。取适 量水解液于 25mL 具塞刻度试管中 ,用 0.1mol/L 氢氧化钠调节 pH 至 6.8,以溴麝香草酚蓝作外 指标剂, 用水稀释至刻度, 使溶液中烟酸含量约为 50ng/mL,此液为样品试液。 6.3 样品试液管的制备 每支试管中分别加入 1.0、 2.0、 3.0、 4.0mL 样品试液 ,需做二组。每管加水稀释至 5mL, 再加入 5mL 基本培养基储备液。 6.4 标准管的制备 每支试管中分别加入烟酸标准使用液 0、 0.5、 1.0、 1
16、.5、 2.0、 2.5、 3.0mL,需做三组。 每管加水稀释至 5mL,再加入 5mL 基本培养基储备液。 6.5 灭菌 样品管和标准管均用棉塞塞好, 于 6.9 10*4Pa(10lb/in*2)压力下灭菌 15min。 6.6 接种和培养 待试管冷至室温后, 每管接种一滴种子液, 于 37 0.5恒温箱中培养约 72h。 6.7 滴定 将试管中培养液倒入 50mL 三角瓶中, 用 5mL0.001溴麝香草酚蓝溶液分二次淋洗试管 , 洗液倒入该三角瓶中, 以 0.1mol/L 氢氧化钠溶液滴定, 呈绿色即为终点, 其 pH 约为 6.8。 7 计算 以烟酸标准系列的不同微克数为横坐标,
17、滴定所需 0.1mol/L 氢氧化钠的毫升数为纵 坐标, 作标准曲线。用样品液所需的氢氧化钠毫升数由标准曲线上查出每样品管中烟酸 含量, 分别计算各管中每毫升样品试液烟酸含量, 用误差不超过平均值 10的测定结果 求出平均值, 按下式计算样品中烟酸的含量。 cVF 100 X m 1000 式中: X 样品中烟酸的含量,mg/100g; c每毫升样品试液中烟酸含量的平均值, g/mL; V样品水解液定容总体积,mL; F样品试液的稀释倍数; m试样质量,g; 100 折算成每 100g 样品中烟酸毫克数。 1000 8 结果的重复性 同一实验室同时或连续两次测定结果相对偏差绝对值10。 附加说明: 本标准由中华人民共和国卫生部卫生监督司提出, 食品卫生标准分委员会审查通过。 本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所起草。 本标准主要起草人王光亚、李小林。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 中华人民共和国卫生部 1990-03-19 批准 1990-12-01 实施
