1、ICS 11220B 41 囝雷中华人民共和国国家标准GBT 1 6550m2008代替GB 16550 19962008-12-31发布新城疫诊断技术Diagnostic techniques for newcastle disease2009-05-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局世士中国国家标准化管理委员会厦干扛刖 曷GBT 16550-2008本标准对应于世界动物卫生组织(0IE)陆生动物卫生法典(2006版)2713“新城疫”和陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)(2006版)2115“新城疫”，且与该章节的一致性程度为非等效。本标准代替GB 16550
2、-1996新城疫检疫技术规范。本标准与GB 16550一1996相比主要变化如下：对标准名称进行了修订，修改为新城疫诊断技术；删除了原标准中属于行政执法行为的内容；对血凝和血凝抑制试验进行了修改；一增加了脑内接种致病指数(ICPI)、静脉接种致病指数(IVPI)；增加了RT-PCR检测方法。本标准的附录A、附录B和附录c均为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、扬州大学。本标准主要起草人：刘华雷、吴艳涛、王志亮、刘文博、马洪超、刘秀梵。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB
3、16550m1996。新城疫诊断技术GBT 1 6550-20081范围本标准规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝试验、血凝抑制试验、反转录聚合酶链式反应(RTPCR)和综合判定。本标准适用于新城疫的诊断。2缩略语下列缩略语适用于本标准。DEPc焦碳酸二乙酯；HA血凝；HAu血凝单位，以完全凝集病毒的血清最高稀释倍数为一个血凝单位；HI血凝抑制；IcPI脑内接种致病指数；IVPI静脉接种致病指数；MDT致死鸡胚平均死亡时间；NDv新城疫病毒；sPF一一无特定病原体。3 I临床诊断31临床症状当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：a)发病急，死亡率高；b)体温升高，极度
4、精神沉郁，呼吸困难，食欲下降；c)粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；d) 出现扭颈、翅膀麻痹等神经症状；e)免疫禽群出现产蛋下降。32病理变化当禽出现下列肉眼可见的病变时，可作为初步诊断定性的依据之一：a)全身黏膜和浆膜出血，以呼吸道和消化道最为严重；b)腺胃黏膜水肿，乳头和乳头间有出血点；c)盲肠扁桃体肿大、出血、坏死；d)十二指肠和直肠黏膜出血，有的可见纤维素性坏死病变；e)脑膜充血和出血，鼻道、喉、气管黏膜充血、偶有出血，肺可见淤血和水肿。当禽出现上述病变时，应进行实验室确诊。4病毒分离与鉴定41病毒分离411样品采集从活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子，后者需带有可见粪便，对雏禽采集拭子容
5、易造成损】GBT 16550-2008伤，可采用收集新鲜粪便代替。死禽以脑、肺脏、脾脏为主，也可采集其他病变组织。412样品处理样品置于含抗生素的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)(pH值7o74)，抗生素视条件而定，但组织和气管拭子保存液中应含青霉素(2 000 UmL)、链霉素(2 mgmL)、卡那霉素(50 pgmL)和制菌霉素(1 000 UmL)，而粪便和泄殖腔拭子保存液抗生素浓度应提高五倍。加入抗生素后调pH值到7074。粪便和搅碎的组织，应用含抗生素的PBS溶液制成10(gmL)20(gmL)的悬浮液，在室温下静置1 h2 h。将粪便或组织的悬浮液在4下以3 0009离心5 min，取上
6、清液进行鸡胚接种。413鸡胚接种用l mL注射器吸取上清液按每枚02 mL，经尿囊腔接种至少五枚9日龄11日龄的SPF鸡胚，接种后，3537孵育4 d7 d。18 h后每8 h观察鸡胚死亡情况。414病毒收获18 h以后死亡的和濒死的以及结束孵化时存活的鸡胚置4冰箱4 h24 h，无菌采集尿囊液。42病毒鉴定421血凝试验对于血凝试验呈阳性的样品采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离的尿囊液继续传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。方法同第5章。422血凝抑制试验采用新城疫标准阳性血清进行血凝抑制试验，确认是否有新城疫病
7、毒繁殖。方法同第6章。43致病指数测定经确定存在新城疫病毒繁殖的情况下，应根据下列指标之一进行毒力判定：a)病毒致死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)的测定：1) 将新鲜的感染尿囊液用灭菌的生理盐水连续10倍稀释成1010 ；2) 每个稀释度经尿囊腔接种五枚9日龄10日龄的SPF鸡胚，每枚鸡胚接种01 mL，置于37培养；3)余下的病毒稀释液于4保存，8 h后，每个稀释度接种另外五枚鸡胚，每枚鸡胚接种01 mL，置于37培养；4) 每日照蛋两次，连续观察7 d，记录各鸡胚的死亡时间；5) 最小致死量是指能引起所有用此稀释度接种的鸡胚死亡的最大稀释度；6)MDT是指最小致死量引起所有鸡胚死亡的平均
8、时间(h)，计算方法见式(1)。2MDT一丝堕半式中：Nxx小时死亡的胚数；ry小时死亡的胚数；x，y胚死亡时间，单位为小时(h)；T死亡的总胚数。b)接种致病指数(ICPI)测定：1)HA滴度高于41092(大于16)以上新鲜感染尿囊液(不超过24 h48 h，细菌检验为阴性)，用无菌等渗盐水作10倍稀释；2)脑内接种出壳24 h40 h之间的SPF雏鸡，共接种10只，每只接种005 mL；3)每24 h观察一次，共观察8 d；4)每天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作l，死鸡记作2，(每只死鸡在其死后的每日观察中仍记2)；5)ICPI是每只鸡8 d内所有每次观察数值的平均数，计算方法见
9、式(2)。 -c婆学GBT 1 6550-2008式中：，8 d累计发病数；d8 d累计死亡数；T8 d累计观察鸡的总数。c)接种致病指数(IVPI)测定：1)HA滴度高于41092(大于116)的新鲜尿囊液(不超过24 h48 h，细菌检验为阴性)，用无菌等渗盐水作10倍稀释；2)静脉接种六周龄的SPF小鸡，接种10只，每只鸡接种01 mL；3)每天观察1次，共10 d，每次观察要记分，正常鸡记作o，病鸡记作1，瘫痪鸡或出现其他神经症状记作2，死亡鸡记作3(每只死鸡在其死后的每日观察中仍记作3)；4) IVPI是指每只鸡10 d内所有每次观察数值的平均值，计算方法见式(3)。IVPI一圣!兰
10、!圣癸!圣!兰! (3)式中：。一一10 d累计发病数；。10 d累计瘫痪数；d10 d累计死亡数；T10 d累计观察鸡的总数。44结果判定结果判定细则如下：a)MDT低于60 h为强毒型NDV，MDT在60 h90 h为中等毒力型NDV，MDT大于90 h为低毒力NDV；b)ICPI越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的ICPI接近20，而弱毒株毒力的ICPI为0；c)IVPI越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的IVPI可达30，而弱毒株的IVPI为0。5血凝试验51材料与试剂511 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔V
11、形血凝反应板。512 pH72磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法参见附录A。513 1鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。514标准新城疫病毒抗原、购入的标准新城疫病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。若不符，应重复检测并到相关实验室验证。52血凝试验操作程序血凝试验操作程序如下：a) 取96孔v形微量反应板，用微量移液器在1孔12孔每孔加0025 mL PBS；b)吸取0025mL病毒悬液加入第1孔中，吹打3次5次充分混匀；c)从第1孔中吸取0025 mL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取0025 mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取00
12、25 mL弃之，设第12孔为PBS3GBT 16550-2008对照；d)每孔再加0025 mL PBS；e)每孔加入0025 mL体积分数为1的鸡红细胞悬液；f)振荡混匀反应混合液，室温2025下静置40 min后观察结果，若环境温度太高，放4静置60 rain，PBS对照孔的红细胞成明显的钮扣状沉到孔底时判定结果。5，3结果判定结果判定细则如下：a)在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。b)如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离的尿囊液
13、继续传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。c)对于血凝试验呈阳性的样品应采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。6血凝抑制试验61材料与试剂611器材同511。612试剂同512。613标准抗NDV血凝抑制抗体(血清)。614 4个血凝单位的病毒液制备：根据42测定的病毒的血凝效价，判定4个血凝单位的稀释倍数。方法举例为：如病毒HA效价为91092，其4个血凝单位为71092，则将病毒稀释128倍即可。615 HI效价高于101092时可继续增加稀释的孔数。6 2 HI试验程序HI试验操作程序如下：a)根据血凝试验结果配制4个血凝单位(4HAU)抗原。以能引起100血凝的病毒最高
14、稀释倍数代表1个血凝单位，4HAU的配制方法如下：假设抗原的血凝滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64(256除以4)，稀释时，将1 mL抗原加入到63 mL PBS中即为4HAU抗原。b)取96孔V形微量反应板，用移液器在第1孔第11孔各加入0025 mL PBS，第1z孔加入005 mL PBS。c)在第1孔加入o，035 mL新城疫标准阳性血清，充分混匀后移出o025 mL至第2L，依次类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去0，025 mL，第11孔为阳性对照，第12孔为PBS对照。d)在第1孔第11孔各加入0025 mL含4HAU抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温
15、下(约2025)静置不少于30 min，4不少于60 min。e)每孔加入o025 mL体积分数为1的红细胞悬液，轻晃混匀后，室温(约2025)静置约40 min，若环境温度太高，放4静置60 min。当PBS对照孔红细胞呈明显钮扣状沉到孔底时判定结果。63结果判定结果判定细则如下：a)在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，看红细胞是否呈泪珠状流下。滴度是指产生完全不凝集(红细胞完全流下)的最高稀释度。只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于21092，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，H1试
16、验结果方判定有效。4GBT 1 6550-2008b)尿囊渡HA效价大于等于41092，且标准新城疫阳性血清对其HI效价大于等于4 l092，判为新城疫病毒。c) 对确定存在新城疫病毒繁殖的尿囊液应进一步测定其毒力，方法见43。7反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)71仪器设备所用仪器设备如下：a)PCR仪；b)高速台式冷冻离心机：最大离心力12 0009以上；c)生物安全柜d)冰箱；e)水浴锅；f)微量移液器；g)组织匀浆器；h)电泳仪；i)电泳槽；j)紫外凝胶成像仪。72试剂所用试剂如下：a)RNA提取试剂Trizol；b)三氯甲烷；c)异丙醇；d)75乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水
17、配制，一20预冷。73操作程序731样品的采集和处理取200 pL离心后的上清提取RNA。也可选择含病毒的鸡胚尿囊液进行RT-PCR鉴定。73。2病毒核酸RNA的提取RNA提取应在样品制备区。应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。提取RNA时应避免RNA酶污染。同时设立阳性对照和阴性对照。用Trizol提取核酸RNA的操作步骤如下(样品以鸡胚尿囊液为例)：a) 在无RNA酶的15 mL离心管中加入200 pL尿囊液后，加入1 mL Trizol，振荡20 s，室温静置10rain；b)加入200 pL三氯甲烷，颠倒混匀，室温静置10rain，以12 000 rmin
18、离心15min；c)管内液体分为三层，取500 pL上清液于离心管中，加入500 pL预冷(一20C)的异丙醇，颠倒混匀，静置10 rain，以12 000 rmin离心15 rain沉淀RNA，弃去所有液体(离心管在吸水纸上控干)；d)加入700 pL预冷(一20)的75乙醇洗涤，颠倒混匀2次3次，以12 000 rrain离心10min；e)调水浴至60，室温下干燥10 rain；f)加人40 pL DEPC水，60金属浴中作用10 rain，充分融解RNA，-70保存或立即使用。733配置RT-PCR反应体系在样品处理区内由专人按表1给出的程序分步进行。注意只能在试剂准备区打开和配制试剂
19、，配制完毕后应及时将剩余试剂放回贮存区域。将适量的核酸样品小心加入装有反应液体的反应管内，盖5GBT 16550-2008紧盖子并做好标记。参照表1中反应体系配置RTPCR扩增。表1 RT-PCR反应体系配置表试剂 体积FL无RNA酶灭菌超纯水 13610缓冲液 25dNTPs 2RNA酶抑制剂 05AMV反转录酶 07Taq酶 07上游引物P1 1下游引物P2 1模板RNA 3总计 25注：上游引物P1的序列为5 7一ATGGGcYccAGAYcTTcTAc一3，下游引物P2的序列为5一CTGCCACTGcTAGTTGTGATAATcc 3 7，Y为兼并碱基。7，34 RT-PCR按照表1中
20、的加样顺序全部加完后，充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入一滴液体石蜡(约20 pL)。同时设立阳性对照和阴性对照。循环条件为：a)第一阶段，反转录4245 rain；b)第二阶段，预变性953 rain；c)第三阶段，9430 s，5530 s，7245 S，30个循环；d)第四阶段，727 rain。最后的RT-PCR产物置4保存。735电泳操作程序如下：a)制备15琼脂糖凝胶板；b)取5 pL PCR产物与05 pL加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中；c)加入DNA分子质量标准物；d)盖好电泳仪，插好电极，5 Vcm电压电泳，30 min40 rai
21、ne)紫外线灯下观察结果，凝胶成像仪扫描图片存档，打印；f)用分子质量标准物比较判断PCR片段大小。74结果判定结果判定细则如下：a)出现05 kb大小左右的目的片段(与阳性对照大小相符，参见附录c)，而阴性对照无目的片段出现方可判为新城疫病毒阳性。b)对于扩增到的目的片段，需进一步进行序列测定，从分子水平确定其致病性强弱。c)根据序列测定结果，对毒株F基因编码的氨基酸序列进行分析，如果毒株F2蛋白的c端有“多个碱性氨基酸残基”，Fl蛋白的N端即117位为苯丙氨酸，可确定为新城疫强毒感染。“多个碱性氨基酸”指在113位到116位残基之间至少有三个精氨酸或赖氨酸。6GBT 16550-20088
22、综合判定81 临床诊断符合第3章规定的临床症状和病理变化，按第4章进行病毒分离与鉴定结果为新城疫病毒阳性且ICPIo7，诊断为新城疫。82临床诊断符合第3章规定的临床症状和病理变化，按第7章进行RT-PCR检测结果呈阳性且经序列分析证明F蛋白裂解位点具有强毒特征，诊断为新城疫。83患禽没有明显的临床症状和病理变化，但病原检测符合81或82，可判定为新城疫病毒强毒感染。7GBT 16550-2008附录A(资料性附录)pH7。2磷酸盐缓冲液(PBS)配制pH72磷酸盐缓冲液(PBS)配制：氯化钠(NaCl)80 g氯化钾(KCl)02 g磷酸氢二纳(NazHPO。) 144 g磷酸二氢纳(KHz
23、PO。)024 g加蒸馏水至 1 000mL将上述成分依次溶解，用盐酸(Hcl)调pH至72，分装，121、15 rain高压灭菌。附录B(资料性附录)1鸡红细胞悬液(RBc)制备GBT 1 6550-2008采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，加入三倍四倍体积的PBS混匀，以2 000 rmin离心5 rain 10 rain，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤三次(洗净血浆和白细胞)，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1的悬液，于4保存备用。9附录c(瓷料性附录)新城疫病毒RT-PCR检测阳性参照围C 1新城疫病毒RToPCR检禹阳性参照图图C 1C 2说明C 2 1琼脂糖凝腔的浓度为1 5。C 2 2 DNA相对分子质量标准物(Marker)为DLZ000啪啪瑚舌瑚啪
