1、lCS 11220B 41 蝠园中华人民共和国国家标准GBT 165512008代替GB 16551-1996猪瘟诊断技术Diagnostic techniques for classical swine fever(hog cholera)2008-12-31发布 2009050 1实施宰瞀职紫瓣訾箍警瞥星发布中国国家标准化管理委员会捉111刖 吾GBT 1655卜一2008本标准对应于OIE最新公布的陆生动物诊断试验和疫苗手册)(2004版)第二部分第二节2113猪瘟(CSF)有关内容，且与该章节标准的一致性程度为非等效。本标准代替GB 16551 1996(猪瘟检疫技术规范。本标准与GB
2、 16551-1996相比主要变化如下：本标准修订了GB 16551 1996中第3章“群体检疫”和第4章“个体检疫”的有关内容，删除了其中有关疫苗免疫、产地检疫和查验检疫证明等中华人民共国动物防疫法等法律法规已有明确规定且不宜作为本标准条款的相关内容，保留和合并了群体和个体CSF临床症状和病理变化的有关章节，单独增写了临床和病理学诊断内容；|本标准将GB 16551 1996中第5章“实验室检验”的内容进行了较大的修订，删除了51，将52中涉及的兔体交叉免疫试验、免疫酶染色试验、病毒分离与增毒试验、直接免疫荧光抗体试验由原标准中附录A(补充件)和附录c(补充件)的编排格式转为本标准中的正文内
3、容，并补充和修订了上述方法，增加了能鉴别诊断CSF自然感染和疫苗免疫抗体的单抗酶联免疫吸附试验，同时，还直接引用了陆生动物诊断试验和疫苗手册(2004版)中的诊断CSF抗体的荧光抗体病毒中和试验，新增了有自主知识产权的诊断CSF病毒的反转录聚合酶链式反应；本标准改变了GB 16551-1996的编写格式，正文采取了对CSF诊断技术分临床和病理学诊断，病原学诊断及血清学诊断三个层次诊断技术的分类编写方式，并根据所列诊断方法的性质，进行划分和归类编写；一一本标准修订了GB 16551 1996中第6章“综合判定”的相关内容，并将容易引起歧义的“综合判定”一词改为“最终结论判定”，增加了与之相吻合的
4、判定标准，使其“综合判定”与诊断结果的分析相一致，删除了现行法律法规已涵盖且不适宜于本标准的第7章“检疫后处理”的有关内容。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：王在时、王琴、丘惠深、赵耘。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB 165511996猪瘟诊断技术GBT 1655120081范围本标准规定了猪瘟(CSF)f临床诊断、病理学诊断及实验室诊断方法的技术要求。实验室诊断方法主要包括：兔体交互免疫试验、免疫酶染色试验、病毒分离与鉴定试验、直接免疫荧光抗体试验、荧光抗体病毒中
5、和试验、猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和反转录聚合酶链式反应等诊断技术。本标准适用于猪瘟的诊断。兔体交互免疫试验，免疫酶染色试验，直接免疫荧光抗体试验，反转录聚合酶链式反应和病毒分离与鉴定试验等五种方法主要用于猪瘟病毒和抗原的诊断，以发现带毒猪和自然感染猪；猪瘟单抗酶联免疫吸附试验和荧光抗体病毒中和试验主要用于猪瘟抗体的监测和免疫效果评估，其中，单抗酶联免疫吸附试验主要用于猪瘟抗体的鉴别诊断，可区别诊断猪瘟自然感染猪，免疫猪，强、弱毒抗体阳性猪及猪瘟抗体阴性猪。2临床及病理学诊断21 临床及病理学诊断的作用感染CSF的猪临床症状和解剖后肉眼所见的病理变化，因病毒株致病力、感染时间和宿主等因素不同而有
6、很大差异，同时田问还存在着无临床症状的猪瘟病毒持续性感染和多种病原混合感染的现象，因此，猪瘟的I临床诊断和病理学诊断只能作为综合诊断定性的依据之一，不能作为确诊的根据，特别是那些隐性感染的带毒猪，一般不表现临床症状及肉眼可见的病理变化，所以，猪瘟的确诊应依赖于对CSF病毒及抗原的实验室诊断，才能形成最终的结论。22临床诊断猪群中被检猪出现下列临床症状时，可作为综合诊断定性的依据之一：a)体温在405以上或间歇性的发热；b)精神萎靡、倦怠，畏寒，食欲不振、厌食、甚至废食，呕吐，步态不稳；c)交替便秘与腹泻，产生带粘液和血丝的粪球，结膜充血、出血或有不正常分泌物；d)鼻盘、嘴唇、耳尖、下颌、四肢、
7、腹下及腹股沟等处出现紫红色斑点或斑块；e) 公猪包皮积尿或其他疑似CSF的症状；f)怀孕母猪有流产、死胎、木乃伊等现象或所产仔猪有衰弱、震颤、痉挛、发育不良等现象。出现上述症状时，猪群作为可疑CSF对待，应全群隔离饲养，并作进一步诊断。23病理学诊断对i临床检出的可疑患猪可抽样进行病理学诊断，下述肉眼可见的病变可作为综合诊断定性的依据之一：a) 肾皮质色泽变淡，有不同大小的点状出血；b)淋巴结外观充血、切面周边出血，呈红白相问的“大理石样”；c)脾脏不肿大，表面有点状出血或边缘出现突起的楔状梗死区；d)心脏、喉头、大肠、小肠、胆囊及膀胱有点状出血；e)全身出血性变化、多呈片状或点状；f) 回盲
8、瓣、回肠、结肠形成“钮扣状”溃疡(慢性猪瘟)。1GBT 1655卜一20083病原学诊断31兔体交互免疫试验311样品处理将病猪的淋巴结、脾脏和肾脏磨碎后用无热原性的生理盐水作1：10稀释。312接种家兔将上述处理的样品肌肉注射三只健康家兔，每只5 mL，另设三只不注射病料而仅注射生理盐水的对照兔，24 h后，每隔6 h测体温一次，连续测温5 d。313接种兔毒接种样品5 d后对所有家兔静脉注射用无热原性的生理盐水稀释成1 mL含有100个兔体最小感染量的猪瘟兔化弱毒(淋巴、脾脏毒)，每只1 mL，同时增设两只仅注射猪瘟兔亿弱毒的对照兔。24 h后，每隔6 h测体温一次，连续测96 h，注射生
9、理盐水和仅注射猪瘟兔化弱毒的两组对照兔分别23和22出现定型热或轻型热，试验成立。314判定标准猪瘟强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，从而能抵抗猪瘟兔化弱毒的攻击。因此，可以利用猪瘟兔化弱毒攻击后是否出现体温反应作指标，以判定第一次接种的病料中是否含有猪瘟病毒。试验组的试验结果判定见表1。表 兔体交互免疫试验结果判定接种病料后体温反应 接种猪瘟兔化弱毒后体温反应 结果判定含猪瘟强毒、野毒上 不含任何猪瘟病毒+ 含猪瘟兔化弱毒+ + 含非猪瘟病毒热原性物质对照兔 + 含猪瘟兔化弱毒注：“+”表示多于或等于三分之二的动物有体温反应，“”为无体温反应。32免疫酶染色试验321样品的采集解剖
10、检查时采病猪扁桃体、脾、肾、淋巴结作压印片或冰冻切片，同时设正常组织对照标本。标本自然干燥后，在2戊二醛和甲醛等量混合液中固定10 rain，干燥后，置冰箱内待检。322操作程序3221将标本浸入001过氧化氢或001叠氮钠的TrisHCI缓冲液中，室温下作用30 min。3222用pH74的002 molL磷酸缓冲盐水漂洗5次，每次3 min，风干。3223将标本置于湿盒内，滴加l：10酶标记抗体，覆盖标本面上，置37作用45 min。3224用pH74的002 molL磷酸缓冲盐水一1吐温缓冲液漂洗5次，每次2 min3 min。3225将标本放人DAB(4一二甲氨基偶氮苯)TrisHCI
11、液内，置37作用3 rain。3226用pH74的002 molL磷酸缓冲盐水冲洗5次，每次2 rain3 min，再用无水酒精、二甲苯脱水，封片检查。3227用普通生物显微镜检查判定结果，如细胞浆染成深褐色为阳性；黄色或无色为阴性，正常对照标本应为阴性。猪瘟兔化弱毒接种的猪组织细胞浆呈微褐色，与强毒株感染有明显区别。33 病毒分离与鉴定试验331 将2 g扁桃体或脾脏或肾脏剪成小块，加上灭菌砂在乳钵中研成匀浆，用HankS液或MEM配2GBT 165512008成20悬液，加青霉素(使最终浓度为500 UmL)和链霉素(使最终浓度为500-gmL)，室温下放置l h，以3 000 rrain
12、离心15 min取用上清液。332将PK。单层细胞用胰酶消化分散后，以800 rrain离心10 min，用不含牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5胎牛血清的MEM配成每毫升含2106个细胞的悬液。333九份细胞悬液(352)加一份病料悬液(331)接种于带有细胞飞片的转瓶或微量细胞培养板。另设不加病料的对照若干瓶(孔)，于接种后l d、2 d、3 d，分别从两个接种瓶(孔)和一个对照瓶(孔)中取出细胞片用Hanks液或MEM洗涤两次，每次5 min，用冷无水丙酮固定10 min。334按32或345347进行免疫酶染色或荧光抗体染色、镜检并判定结果。3，4 直接免疫荧光抗体试验341采样群体检疫
13、中，待检可疑猪不少于三例，其中至少两例为早期患猪，活体取扁桃体或剖杀磊摘取扁桃体。后期病猪剖杀后采扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏。个体检疫时，可活体取扁桃体或剖杀可疑猪采扁桃体、淋巴结、脾脏和肾脏。所采组织样品应新鲜且为猪瘟疫苗免疫21 d之后。342送检采样后应尽快冷藏送检，如当日不能送出，应冻结保存，避免组织腐败、自溶，影响结果。343制片将样品组织块修切出1 cmXl crn的小块，不经任何固定处理，直接冻贴于冰冻切片机的冰冻切片托上(组织块太小时，如活体采取的扁桃体可用冰冻切片机专用的包埋剂或化学浆糊包埋)，进行切片，切片厚度要求5 pm7 pm。将切片展贴于o8 mm10 nllTl厚的
14、洁净载玻片上，也可将样片组织直接作压印片或涂片，同时设正常对照片。344固定将切片、压印片或涂片置无水丙酮中固定15 min。取出立即放人001 molL，pH72的磷酸缓冲盐水中，轻轻漂洗3次。取出，自然干燥后，尽快进行荧光抗体染色。3，45荧光抗体染色将猪瘟荧光抗体滴加于样品片表面，放置湿盒内于37作用30 rain。取出后浸人磷酸缓冲盐水中充分漂洗，再用带有05 molL，pH90pH93碳酸盐缓冲甘油的盖玻片(o17 mm厚)封固样品片表面。染色后应尽快镜检，4保存不应超过72 h。必要时可低温保存待检，但也不应超过一周。346镜检将染色、封固后的样品片置于激发光为蓝紫光或紫外光的荧光
15、显微镜下观察。3，47判定标准于荧光显微镜视野中，见扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光，或脾、淋巴结胞浆内有黄绿色荧光判为猪瘟病毒感染阳性。正常对照片细胞内应无黄绿色荧光。35猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)351材料与样品准备3511材料准备本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；各种离心管和带滤芯吸头需无RNA酶污染；剪刀、镊子和研钵器应经于烤灭菌。3512样品制备按1：5(质量浓度)比例，取待检组织和MEM液于研钵中充分研磨制成匀浆液，4，以1 000 g离心15 rain，取上清液转入无RNA酶污染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培
16、养物冻融3次备用；其他样品酌情处理。制各的样品在z8保存不应超过24 h，长期保存应小分装后置一70以下，避免反复冻融。同时设阴、阳性样品对照。3GBT 165512008352 RNA提取3521 移取750 pL Trizol至15 mL Eppendorf管，加入200 pL血液(培养液或组织处理上清)，旋涡振荡20 s，室温下作用5 rain。加入200 pL三氯甲烷，旋涡振荡15 S，室温下作用10 rain。3522以12 000 rmin(1l 7509)，4离心15 min。3523轻轻吸取上清转至新的15 mL Eppendorf管(注意不要吸到中间蛋白层)，约550 pL6
17、00 pL，加入等量预冷的异丙醇，颠倒数次混匀，一20条件下静置至少10 rain。3524以12 000 rrain(11 7509)，4离心15 min。3525轻轻倒掉上清，顺势将管口残液在吸水纸上醮于(注意各管不要用吸水纸同一点)，向管中轻轻加入1 mL预冷的75乙醇。轻轻颠倒数次，将乙醇倒掉，将管口残液在吸水纸上醮干(注意各管不要用吸水纸同一点)，盖上盖后，以5 000 rmin，4离心2 rain。3526用洁净无酶吸头将管底乙醇吸干，注意不要吸走沉淀(RNA少的情况下可能看不见沉淀)。在安全柜或超净台中将残留的乙醇吹干，约5 rain，直至无乙醇味为止。时间不要太长，以免RNA溶
18、解困难。3527用下列比例配制溶液溶解RNA：4L 01 molLMDTT1 pL RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)15 pL无酶水共计20 pL，按此比例一次性配好，混匀。按每个样品20 pL50 pL配制。吸取20 pL50乩RNA溶解液溶液加至Eppendorf管底，5565水浴助溶10 rain。RNA溶液在一80保存。短期也可在一20保存。353 cDNA合成3531吸取5 pL上述RNA溶液至PCR管中。3532加入1 pL 50 pmolL的下游引物，68作用5 rain，冰水浴中降温(或在PCR仪中采用程序：68反应5 rain。置于4结束反应)。3533加入下
19、列试剂：2 pL 5第一链缓冲液(first strand buffer)05“L 01 molLDTT05 pL dNTP(10 mmolL)025 pL RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)05 pL反转录酶(superscript lI)PCR仪中50反应60 rain，75温育10 rain，置于4结束反应。354 PCR3541吸取上述cDNA模板3 pL，无酶水345 pL。3542加入下列试剂：5 pL 10PCR缓冲液3“L dNTP(10m toolL)l pL 上游引物1 pL 下游引物25 pL TaqDNA聚合酶将混合物吹打均匀后，至PCR仪中扩增，条件如下
20、：94预热3 rain，94变性50 S，58退火50 S，72链延伸1 rain 40 S，30个循环，72温育10 rain。置于4结束反应。355 nest-PCR3551吸取上述PCR模板15 pL，无酶水36 pL。43 5 5 2加人下列试剂：5 vL 10PCR缓冲渣3 ttL dNTP(10 mmolL)1 t,L nest上游引物1 gL nest下游引物2 5L Taq DNA聚合酶将混台物欢打均匀后，至PCR仪中扩增条件如下：94预热3 min，94变性50 st54退火50 s72链延伸1 min 40 s，30十循环，72温育10 rain，置于4结束反应。3 5 6
21、电泳取6 pL10 ttL PCR产物在0 8斯琼脂糖凝腔中进行电泳，缓冲藏为0 5TBE100 V，40 min。3 5 7凝腔成像墨结果判定阳性样品出现1 2 k大小条带、阴性样品无条带出现时试验成立。被检测样品出现1 2 k大小条带为猪瘟阳性，否则为阴性见圉1圈4血清学谚断4 1荧光抗体病毒中稀试验4 1 l细胞准备4 1 l 1将浓度为每毫升含2105个细胞的PK”细胞悬液接种到于带有盏玻片的Leighton臀、培养瓶或微量细胞培养板中。4 1 1 2于37二氧化碳(CO。)培养箱中培养1 d2 d直至有70“80的细胞形成单层Leigh。ton管可用酱通培养糟培养。4 l 2捕毒中和
22、4 1 2 1被检血清于56灭活30min，在国际贸易中，最好作1：5稀释(终浓度1：10)。在国内作抗体水平普查时，被检血清可作1：25稀释(终浓度1：50)4 1 2 2将稀释的血清与音有200TCIDs。0 1 mL的病毒悬藏等体积捏合置37作用1 h2 h。4 1 3中和后的精毒接种4 1 3 1将带有盏玻片的Leighton瞥，培养瓶或微量细胞培养板t用无血清培养液洗涤3趺后用血薛-旃毒中和后的混合物接种在带有盏玻片的Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板上-置于37温5GBT 165512008箱作用1 h，同时设置标准的阴、阳性血清中和对照，没有血清中和的病毒对照和正常细胞对
23、照。4132在Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板中加入细胞维持液，并将细胞培养物继续置于37温箱培养2 d以上。414荧光抗体染色4141从Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板中取出带有细胞的盖玻片，用pH72的磷酸缓冲盐水洗涤细胞单层2次，每次5 rain，后用无水丙酮固定10 rain，再将工作浓度的猪瘟荧光抗体结合物滴加在带有细胞的盖玻片上，放置湿盒中，于37染色30 min，并用pH72的磷酸缓冲盐水冲洗3次。4142用pH值9o93的90V00碳酸盐一甘油缓冲液将盖玻片封固在无油渍的显微镜载玻片上，并在荧光显微镜下作荧光检查。415镜检将染色、封固后的样品片置于激发光为
24、蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。416判定标准4161 当在荧光显微镜下，正常细胞对照和标准阳性血清中和对照的细胞胞浆中无黄绿色荧光，标准的阴性血清中和对照和没有血清中和的病毒对照的细胞胞浆中有黄绿色荧光时，试验成立，可判定被检样品的结果。4162荧光显微镜下，被检样品的细胞胞浆内未见黄绿色荧光时，判为猪瘟抗体阳性；被检样品的细胞胞浆内有明亮的黄绿色荧光时，判为猪瘟抗体阴性。42 猪瘟单抗酶联免疫吸附试验421材料准备猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原，猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原，酶标结合物，标准阴、阳性血清，酶联板及其他必要的试验溶液。422操作方法4221抗原包被用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、
25、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原分别作100倍稀释，以每孔100 fzL分别加入做好标记的酶联板孔中，置于湿盒放4过夜。4222洗涤甩掉酶联板孔内的液体，加入洗涤液，室温下浸泡3 min，甩去洗涤液，再重新加入洗涤液，连续洗涤三次，最后一次甩掉洗涤液后，拍干酶联板。4223加入被检血清用稀释液将被捡血清作400倍稀释，每孔加100 pL。同时，将猪瘟标准阴、阳性血清以100倍稀释作对照，置湿盒于37作用15 h2 h，甩掉酶联板中稀释的血清，用洗涤液冲洗三次，洗涤方法同4222。4224加入酶标抗体结合物用稀释液将酶标抗体结合物作100倍稀释，每孔加入100 pL，置湿盒于37孵育15 h20 h。甩
26、掉酶标抗体结合物，用洗涤液冲洗三次，洗涤方法同4222。4225加底物每孔加入新配制的底物溶液(每块96孔酶联板所需底物溶液按邻苯二胺10 mg加底物缓冲液10 mL加30过氧化氢3750 pL配制)100 pL，室温下观察显色反应，一旦阴性对照孔略显微黄色，立即终止反应。4226终止反应每孔加入终止液50 pL后，迅速用酶联读数仪以490 nro波长测定每孔的光吸收值(oD)，并以阴性血清孔作为空白对照调零孔。6GBT 165512008423判定标准4231在猪瘟弱毒酶联板上：ODO2，为猪瘟弱毒抗体阳性；ODO2，为猪瘟弱毒抗体阴性。4232在猪瘟强毒酶联板上：ODo5，为猪瘟强毒抗体阳
27、性；ODo5，为猪瘟强毒抗体阴性。424判定结论4241同一份被检血清，当在猪瘟弱毒酶联板上，结果为阳性，而在猪瘟强毒酶联板上，结果为阴性时，表明被检猪为猪瘟疫苗免疫猪。4。2。4。2同一份被检血清，当在猪瘟弱毒酶联板上，结果为阴性，但猪瘟强毒酶联板上为阳性时，表明被检猪是猪瘟强毒抗体阳性猪，该猪按3135中任何一种试验做猪瘟抗原检查，以确定是否为带毒猪。4243同一份被检血清，当在猪瘟弱毒和强毒酶联板上，结果均为阳性时，表明被检猪为猪瘟强、弱毒抗体阳性猪，该猪应按3135中任何一种试验做猪瘟抗原检查，以确定是否为带毒猪。4244同一份被检血清，当在猪瘟弱毒和强毒酶联板上，结果均为阴性时，表明被检猪为猪瘟抗体阴性猪，该猪应按3 135中任何一种试验做猪瘟抗原检查，以确定是否为带毒的免疫麻痹猪或是真正的猪瘟阴性猪。5最终结论判定下列任何情况之一，均可判定为CSF感染猪：a) 发病不分年龄、季节、个体临床表现明显，病理解剖病变典型，用3135中任何一种试验确诊为CSF病毒或抗原阳性者；b) 临床症状和发病情况不详，群体謦剖检查病变典型，用3135中任何一种试验确诊为CSF病毒或抗原阳性者；c)发病情况、临床症状、病理变化不详、不明显或不典型，但用3135中任何一种试验确诊为CSF病毒或抗原阳性者。
