1、ICS 65120B 46 亘中华人民共和国国家标准GBT 21 1032007动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法Identification of mammal derived materials in animaloriginated feedstuffs-Real time PCR method2007-10-24发布 2008-04-0 1实施宰瞀髁紫瓣警糌赞星发布中国国家标准化管理委员会反111刖 罱GBT 211032007本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁
2、出入境检验检疫局、宝生物工程(大连)有限公司、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹际娟、李晶泉、郑秋月、徐吴、张舒亚、于爱丽、王玉萍、陈颖、徐宝梁、高宏伟、宗卉、金东权。本标准首次发布。动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法GBT 2110320071范围本标准规定了动物源性饲料中哺乳动物源性成分(包括牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、猫等)实时荧光PCR检测方法，该检测方法的检出限为01。本标准适用于动物源性饲料中哺乳动物源性成分的定性检测。2规范性
3、引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样(GBT 1469912005，ISO 6497：2002，IDT)SNT 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31实时荧光PCR real time PCR实时荧光聚合酶链式反应。32Ct值cycle time每个反应管内的荧光信号
4、达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA的12S核糖体RNA(12S ribosomal RNA，12S rRNA)基因上哺乳动物与非哺乳动物种间序列差异而进行哺乳动物源性成分鉴定。利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。以实时荧光检测技术，采用多重PCR方法，将所用试剂配制成预混合形式，组建成实时荧光PCR哺乳动物DNA检测试剂盒。在同一反应管内对哺乳动物的12S rRNA基因及内参照基因同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质6一羧基荧光素(6一carboxyfluoresc
5、ein，FAM)、5-六氯荧光素(5一hexachlorofluorescein，HEx)的探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对动物源性饲料中哺乳动物源性成分进行快速检测。5试剂与材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB 6682的要求。】GBT 21103200751 DNA提取用试剂511三氯甲烷。512异戊醇。513异丙醇。514 70乙醇。515裂解液：1CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，005 molLT
6、risHCI(pH 80)-Tris一：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷，07 molLNaCI，001 molL EDTA(pH8O)(ethylene diaminetetraacetie acid，乙二胺四乙酸)。516 TE缓冲液(TrisHCl、EDTA缓冲液)：10 mmolL TrisHCI(pH80)，1 mmolL EDTA(pH80)。52 实时荧光PCR哺乳动物DNA检测试剂盒521 2哺乳动物源性检测预混合液含有Ex Taq HS(终浓度125 U25 pL)、dNTPs(终浓度各04 mmolL)、Me+(终浓度3
7、mmolL)。522哺乳动物源性检测引物混合液含有扩增哺乳动物基因组DNA及内参照的引物(序列详见表1)、内参照(A DNA)。各引物终浓度01 tLmolL101molL。表1 哺乳动物殛内参照引物序列名称 序 列哺乳动物5t_引物一1 5-AGTGCTTAGTTGAATTAGC,CCATG-3哺乳动物5一引物一2 5-AGTGCTTAATTGAACAAGGCCATG-3哺乳动物5-引物一3 5-AGTGCTTGATTGAATAAGGCCATG-3哺乳动物5-引物一4 5-AGAGCTTAATTGAATCAGGCCATG一3哺乳动物5-引物一5 5 r_AGAGCTTAATTGAATACW-
8、W-七CATG-3哺乳动物5 7-引物6 5-AGAGCTCAATTGAATCGCW_挖CATG-3哺乳动物3-iJl物一1 5-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3 7哺乳动物3一引物一2 5-TTACCTTGTTACGACTTGTCTCCT-3内参照5-引物 5-GGCTGATTGACCCWXAGATTA-3内参照3-引物 5-GCGC)GTATAGGTTTTATTGATGGC-3523哺乳动物源性检测探针混合液含有检测哺乳动物基因组DNA的探针及检测内参照的探针(序列详见表2)。探针浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧
9、光探针的具体使用要求进行。表2哺乳动物及内参照探针序列名称 序 列哺乳动物探针 5(FAM)一CGCACACACCGCCCGTCACCC一3(Eclipse)内参照探针 5(HEX)一CCGCCACGACGATGAACAGACGCT一3(Eclipse)GBT 21 1032007524阳性对照用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照。525双蒸水。6仪器与设备61实时荧光PCR检测系统。62核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。63电子天平：感量001 g。64离心机：离心力12 000 g。65 微量移液器：05 pL10肛L，10 tzL100 pL，10zL200弘L，100 pL1 000
10、 pL。66实时荧光PCR反应管。67恒温水浴箱。7试样的选取与制备按照GBT 145991采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。8检验步骤81 DNA提取称取适量饲料(饲料粒度为100目称取50 mg60目称取100 mg；20目称取200 mg)于15 mL离心管中，加入600 pL800 pL裂饵液，6530 min，期间每隔10 min振荡混匀；12 000 rmin离心5 min，吸取上清液至一新离心管中，加400 pL三氯甲烷+异戊醇(24+1)，充分混匀；12 000 rmin离心5 min，吸取上清液至一新离心管中，加08倍体积异丙醇，室温下沉淀1 h2 h；12 000
11、 rmin离心10 min，弃上清液；70乙醇洗涤一次，晾干；加入50 pL TE，溶解沉淀。也可用等效的DNA提取试剂盒提取模板DNA。82 DNA浓度和纯度的测定取5 pL DNA溶液加双蒸水稀释至1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的吸光值Azeo和Azm DNA的浓度按式(1)计算：cAXNX 501 000 (1)式中：cDNA浓度，单位为微克每微升(zgtzL)；A260 nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当AA280比值在1719之间时，适宜于PCR扩增。83实时荧光PCR检测831反应体系的体积为25 pL，2哺乳动物源性检测预混合液加125
12、 pL，哺乳动物源性检测引物混合液和哺乳动物源性检测探针混合液各加1 pL，样品DNA(1 ngpL100 ngpL)1 pL，加双蒸水至25 pL。832在各实时荧光PCR反应管中加人上述试剂后，盖紧管，离心5 s10 s。833将离心后的实时荧光PCR反应管放人实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。834实时荧光PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为：9510 s，1个循环；955 s，6030 s，40个循环，在每次循环的退火时收集荧光。3GBT 21 1032007835检测结束后，根据扩增曲线和ct值判定结果。836检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已
13、知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照。用已知不含哺乳动物源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。注：也可用等效的哺乳动物源性成分实时荧光PCR检泓试剂盒进行实时荧光PCR检测。9结果判断与表述91 结果分析条件设定直接读取检溅结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。92结果判定921对照结果空白对照：无FAM荧光信号检出。有HEX荧光信号检出，ct值应35为无效值(详见表3)。表3结果的判定情况FAM荧光 HEX荧光 结果判定情况同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测实际样品时，如果有FAM+ + 荧光和HEX荧光检出，且ct值3s，判定为吉有哺乳动物
14、源性成分；如果Ct值35，可视为不含有哺乳动物源性成分。同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测实际样品时，HEX荧光信号未检出，ct值35(itI果检测样品浓度高会抑制内参照DNA的扩增)；如果有+FAM荧光检出，且Ct值35，判定为含有哺乳动物源性成分；如果FAM荧光ct值35，可视为不舍有哺乳动物源性成分。同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常，检测实际样品时有HEX荧光+检出，无FAM荧光检出，判定为不含有哺乳动物源性成分。PCR反应失败。注意以下几个方面后再次进行反应。如果同时进行的陪性对照实验结果正常，则可能是样品DNA制各有问题如样品中可能存在PcR反应的抑制物等。如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或试剂失括。93结果表述检出哺乳动物源性成分。未检出哺乳动物源性成分。410检测过程中防止交叉污染的措施按照SNT1193执行。11废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。GBT 21 1032007
