1、中华人民共和国国家标准工GB/T 14643.5一93MPN法lndustrial circulating cooling waterSulfate码reducingbacteriaMPN test 1 主题内容与激用范围本标准规定了工业循环冷却水中硫酸盐还原菌的测定方法.本标准运用于工业循环冷却水中硫酸盐还皇军茵幸亏苦苦定，也运用于凉水、生活用水及幸吉普在中硫酸盐还原菌的测定。2 引用标准GB 603 化学试:IfiJ试验方法所F吉普普熟j及啦!品的吉普备GB 6682 分析实毅窒烧水规格和试绘方法3 方法提要本法采用多试管发酵技术，在29士1(;培养Zld.如果试管内产生黑色沉淀并伴有疏化
2、氛臭味的表魏l!l位反应，采窍生.!:PN技术宜于被吉普试挥中部署革竣盐还原葛进行计数。4 试剂和材料本试验方法中，除特殊规定外，应使用分析纯试剂和符合GB6682中三级水的规格。4. 1 磷酸氢二号军HG31228)， 4.2 氯化镀(GB658) 1 4.3 硫酸销(GB9853); 4.4 氯化钙;4.5 硫酸簇(GB671), 4.6 乳酸销;4.7 酵母汁z生化试剂，4. 8硫酸亚铁锁(GB661), 4.9 维生素C，4.10 氯化锁(GB12在自); 4. 11 氢氧化纳(GB629) :40自IL洛液，4. 12 :Ii!i.酸(GB622):1+1l溶液p4.13 硫代硫酸纳
3、(GB637) 1 4. 14 乙董事(GB678):75%(V!V)溶液54.1 5 牛皮纸34.16 医用脱脂棉。困家技术监督局1993-08-06批准1994-07-01实施520 GB/T 14643.5-93 5 仪器和设备5. 1 无菌箱(室)或超净工作台s5.2 蒸汽压力灭菌器s5.3 生化培养箱，5. 4 电热干燥箱温度可控制在(60280)士2C，5.5 电热恒温水浴锅g恒温范围(37100)士1C ; 5. 6 J度吸管:lmL; 5.7 刻度吸管:5mL;5.8 试管:150mmX15mm并配上密封的塞子g5.9 试管架s5.10 刻度一角瓶:500mL; 5. 11 磨
4、口一角瓶:100mL，5.12 磨口试剂瓶:1000mL，5. 13 容量瓶:1 OOOmL。6 试验前准备6. 1 无菌水的制备将水分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶40mL.每个三角瓶塞子和瓶口问插入一小纸片来防止粘连，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎，以防污染，用蒸汽压力灭菌器121士lC灭菌15min。6.2 培养基的制备6. 2. 1 称取下列试弗d: 磷酸氢二饵O.5g; 氯化镀1.饨，硫酸销O. 5g; 氯化钙O. Ig, 硫酸续2.饨，乳酸纳3.5g, 酵母汁1. Og , 将上述试剂溶解在1OOOmL水中，用氢氧化销溶液(4.11)或盐酸溶液(4.12)调节pH至7.2士O.2
5、.并分装在500mL刻度三角瓶中，每瓶不超过350mL，瓶口塞上棉塞，并用牛皮纸包好，用蒸汽压力灭菌器121士1C灭菌15mino6.2.2 硫酸亚铁锁溶液s在培养基使用的当天称取1.2g硫酸亚铁钱，在无菌箱室)内均匀地摊在离紫外线灯30cm处灭菌30min，在无菌操作下，把硫酸亚铁镀溶解于事先准备好的无菌水(6.1)中，混匀。6.2.3 维生素C溶液z在培养基使用的当天称取O.4g维生素C，在无菌箱(窒内均匀地摊在离紫外线灯30cm处灭菌30min。在无菌操作下，把维生素C溶解于事先准备好的无菌水(6.1)中，混匀。6.2.4 在无菌操作下，按每100mL培养基(6.2.1)各加入1.0mL
6、硫酸亚铁镀溶液(6.2.2)和l.OmL维生素C溶液(6.2.3)，6.3 无菌稀释水的制备6. 3. 1 生理盐水的配制称取8.50g氯化纳溶解在1000mL水中，混匀。6. 3. 2 将生理盐水(6.3. 1)分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶45mL.每个三角瓶寨子和瓶口间插入-小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器121士IC灭菌15min 0 521 GB/T 14643.5-93 6. 4 刻度吸管的灭菌6.4.1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约1015mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6.4.2 每
7、支刻度吸管用I条约4050mm宽的牛皮纸条，以450左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余纸条折叠打结，不使散开。标上度量，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于160土2C灭菌2ho6. 5 试管的灭菌将洗净并烘干后的试管塞上密封的塞子，数支一捆，每捆管口用牛皮纸包扎，置电热干燥箱中，于160士2C il(菌2ho6.6 采样瓶的灭菌将洗净并烘干后的1OOOmL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中，于160士2C灭商2h。6.7 硫代硫酸纳灭菌将硫代硫酸销放在无菌箱(室)内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处灭菌30mino7 测定步骤7.1 水样的采lU7. 1.
8、1 用无菌采样瓶采集被测样品，在取样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶内要灌满水祥。7. 1. 2 若采集的水中有余氯，应在采样前，在无菌操作下，于无菌采样瓶(6.6)中加入硫代硫酸销(6. 7) ，加入量为每升水样约O.泣。7. 1. 3 水样采集后，应立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，于4lWC保存，存放时间不宜超过24ho经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，于30C左右活化45h，再进行测定。7.2 无菌箱(室)灭菌把试验所用的元菌培养基、无菌稀释水、无菌吸管等用品放入无菌箱(室)内，打开紫外线灯灭菌30mino 7.3 水样的稀释和接种
9、7. 3. 1 水样放入灭过菌的无菌箱(室)(7.2)中，立即用75%(V/V)乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱(室内的酒精灯。7. 3. 27. 3. 7条操作应在无菌箱(室内火焰区进行。7. 3. 2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后无硫酸盐还原菌生长，在空白稀释水样瓶(6. 3)上标上稀释度数。7.3.3 用10倍稀释法稀释水样，即用5mL无菌吸管(6.4)吸取5mL水样注入到U45mL空臼稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10107. 3. 4 另取一支5mL元菌吸管吸取5mL稀释度为10-1水样注入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为l02，依次类推，直至需要
10、的稀释度为止。7.3. 5 将水样(包括稀释水样分别接种于无菌试管(6.5)中，试管置试管架上，每个稀释度重复接种5管(根据需要也可重复接种3管或4管)每管接种lmL，每接一个稀释度更换一支无菌吸管。7.3. 6 另取一组试管不接水样作为空白。7.3. 7 用事先在水浴上加热至60C，并迅速冷却到20C的无菌培养基(6.2.4)灌满试管(7.3.5)(7.3.6)盖上密封盖子。7.4培养;)22 GfT 14643.5-93 在生化培养箱中，于29士1C培养21d。8 :十数与报告B. 1 凡产生黑色沉淀并伴有硫化氛臭味的表示有硫酸盐还原商存在，以十(阳性)表示，其余试管以(阴性)表示。8.2
11、 如果空白出现汩诠反应.表明测定过程中有污染，本次测定无效-8.3 算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录F来。8.4 在10进位草草释中多于三个草草草季度树，极性组合的指数只簿要勇其中依次的25个草毒草季度，对这三三个稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应的最大穗释度，然后逃出其次相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数(见表例1、2、4)。8.5 若按照8.4规定的原则选出三个稀释度后，有更高的满释仍然产生一个黯饺试管，就应该将这一个阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中见袭1例幻。8. 6 根据限性然合的指数，查表附录A)得出最大可能菌数(MPN)除以限性级合指数的第一位数字
12、的稀释!l数，即为每毫升7)样中硫酸盐还原榕的菌数如果每个稀释度重复接种4管或3管，根据阳性组合的指数查附录B表自1或附录C表Cl).告毒寻撞稀稀度、生长情况及阳性试管数阳性组合指数报告方式例次个jmL10-霍10-3 10-4 10 10-1 卡一t+十+十十+十一一-一一一一一一5.0110- = 50 520 l 5 5 2 。卡十+十十十+十十一+十一一一一二一25110=25 542 2 4 2 。5 十+十一十一一一-十一14/10= 14 卜十十十卡532 3 3 l l 。5 十十十十+十十十十一一一一3.5/10 =3.5XI0 +十十十510 4 5 5 5 1 。9精密度
13、9.1 由于微生物是不稳定的，精确的试验不能实珑，糖密度表达仅能按MPN程序，9.2 iE样品中细密的分布是不规则的，有时细菌成倦地吸附到小颗拉上，MPN正确度随着平行智的增加而增加，当使用5个子行管时，每管加1mL样品时测定结果的置信度为95%。523 指数个/mL指鼓000 0.0 203 001 0.2 210 002 0.4 211 010 o. 2 212 011 0.4 220 012 0.6 221 020 。.4 222 021 。.6 230 030 0.6 231 100 0.2 240 101 0.4 300 102 。6301 103 0.8 302 110 0.4 3
14、1古111 0.6 311 112 0.8 312 120 0.6 313 121 0.8 320 122 1. 0 321 130 0.8 322 l.l1 1. 0 330 141 1. 1 331 200 0.5 340 201 0.7 341 202 0.9 350 l24 GB/T 14643.5-93 隙袋A.n个平行管最大可能的菌徽补充件表Al个/mL指数个/mL1. 2 400 1. 3 0.7 401 1. 7 。.9402 2.0 1. 2 403 2.5 。.9 410 1. 7 1.2 411 2.0 1. 4 412 2.5 1. 2 420 2.0 1. 4 421
15、 2.5 1.4 422 3.0 0.8 430 2.5 1. 1 431 3.0 1. 4 432 4.0 1. 1 440 3.5 1.4 441 4.9 1. 7 450 4.0 2.口451 4.0 1.4 500 2.5 1. 7 501 3.0 2. 0 502 4.0 1.7 503 6.0 2.0 504 1.5 2.0 510 3.5 2.5 511 4.5 2.5 512 6.0 指数个/mL513 8. 5 520 5.0 521 7.0 522 9. 5 523 12.0 524 15.0 525 17.5 530 8.0 531 11.0 532 14.0 533 1
16、7. 0 534 20.0 535 25.0 540 13.0 541 17.0 542 25.0 543 30.0 544 35.0 545 45.0 550 25.0 551 35.0 552 60.0 553 90.0 554 160.0 555 180.0 指数个!mL指数000 。113 001 0.2 120 002 0.5 121 003 在7122 010 O. 2 123 Oll 0.5 130 012 0.7 131 Ol:l 0.9 132 020 0.5 140 021 0.7 141 022 。.9 200 030 0.7 201 031 0.9 202 040 0.
17、9 203 。411. 2 210 100 0.3 211 101 0.5 212 102 。自213 103 1. 0 220 110 0.5 221 111 0.8 222 112 1. 0 230 G/T 14643.5-93 附录B四个平行管时最大可能商数补充件我B1个/mL指数个ImL1. 3 231 2号0.8 240 2.0 1. 1 241 3.0 1. 3 30。1. 1 1. 6 301 1. 6 1. 1 302 2.0 1. 4 303 2.5 1. 6 310 1. 6 1. 4 311 2.0 1. 7 312 3.0 0.6 313 3. 5 0.9 320 2.
18、。1. 2 321 3.0 1. 6 322 3. 5 在曹330 3.0 1. 3 331 3. 5 1. 6 332 4.0 2.0 333 5.0 1. 3 340 3. 5 1. 6 341 4.5 2号400 2.5 1. 7 401 3. 5 指数个/mL402 5.0 403 7. 0 410 3. 5 411 5.5 412 8.0 413 11.0 414 14. 0 420 6. 0 421 9.5 422 13.0 423 17.0 424 20.0 430 11. 5 431 16. 5 432 20.0 433 30.0 434 35.0 440 25.0 441 4
19、0.0 442 70.0 443 140.0 44 160.0 525 指数个/mL000 。001 0.3 010 O. 3 011 O. 6 。200.6 100 0.4 101 O. 7 102 1. 1 110 。7111 1. 1 120 1. 1 121 1. 5 130 1. 6 200 0.9 附加说明.GB/T 14643.5-93 附录C三个半衍管提大可能的商数(补充件表Cl指数个/mL201 1. 4 202 2.0 210 1. 5 211 2.0 212 3.0 220 2.0 221 3. 0 222 3. 5 223 4.。230 3.0 231 3. 5 323 4.0 300 2.5 301 4.0 本标准由中华人民共和随化学工业部提出。本标准由化工部天津化工研究院1月口。本标准自南京大学和离家中I水处理公司负责起革命本标准主要起草人T美芳、解正宽、蒋振祥、曾昭琪。526 指数个/mL302 6.5 310 4.5 311 7.5 312 11. 5 313 16.5 320 9.5 321 15罔O322 20.0 323 30.0 330 25.0 331 45.0 332 110.0 333 140.0
