1、中华人骂共和国墨家摄准工业循环冷却水中铁细菌的测定MPN法GB/T14643.6-93 Industrial circulatin草cool拍.gwater-Exami统ationof iron bacteria MPN test 1 主董事内容与适用范想本拟准规定了工业循环冷却水中铁细菌的测定方法。本标准适用于工业循环冷却水中铁细菌的测定，也适用于原水、生活用水及粘泥中的铁细菌的测定。2 号ll程标准G日603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法挂是要本法采用多试管发酵技术，在29:1:1C培养14d，如果试管内棕色消失而且形成褐色或黑色
2、沉淀，表明阳性反应，采用MPN技术，对被测试样中的铁细菌进行计数。4 试剂和材料本试验方法中，除特殊规定外，El使用分析纯试剂和符合GB6682中三级水魏格的水位4. 1 硫酸缕(GB671) I 4.2 硫酸镀(GB1396) , 4.3 磷酸氢二铮HG3-1228); 4.4 靠在化钙p4.5 硝酸销(GB636); 4. 6 拧橡酸铁镀$4. 7 1;(化纳(GB1266) , 4.8 氮氧化然(GB629)溶液:4地/L;4.9 载自童(GB622)溶液$1十11J4.10 硫代硫酸纳(GB637) , 4. 11 乙型事(GB678)溶液:75%(V/V)，4.12 牛皮纸s4.13
3、 医学脱ll榜。5 仪器和设备5. 1 .吃边箱(室或辈革净工作台s5.2 蒸汽压力灭蔼器;国家技术监督局1993-08-06批准1994-07-01实施527 G嚣/T14643.6户甲935.3 生化培养籍;5.4 电热干燥箱:温度可控制l在(60280)士2C，5.5 刻度吸管:lmLj5.6 亮!度吸管，5mL，5. 7 试管，150mmX15m阻;5.8 试管架;5啕9磨口三角瓶，100mL，5.10 磨口试剂瓶，1OOOmL , 5. 11 容量瓶:lOOOmLo 6 试验前准备6. 1 培养基的制备称取下91J试剂z硫酸续0.5g, 硫酸镀0.5日:硫酸氢:何0.5g, 氯化钙0
4、.2g, 磁毅销0.5g; 拧橡酸铁锁10.0g。将k述试剂溶解在1000mL水中，用氮氧化纳溶液(4.的或盐酸济液(4.9)调节pH 6.8士O.2. 并分装在试管中，每管5mL.寨L棉塞，数文掘，每捆管口用牛皮纸包扎，用蒸汽压力灭黯糖121土1C 灭吉15min o 6.2 元菌草草释水的翻备6.2.1 生理盐水的配制=称取8.50g氯化纳溶解在1OOOmL水中，混匀。6.2.2 将生观盐水(6.2.1)分装在100mL膀口三角瓶中，每瓶45mL。每个三角瓶塞子和瓶口问插入小纸片，辈革紧瓶塞，每个瓶子的报口用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭黯器121士1C灭离15mino6.3 刻度吸智的
5、灭葱6.3.1 将洗净并烘干后的刻度吸管粗端寨上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约1015mm.棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6. 3.2 每支刻度吸管用一条约4050mm宽的牛皮纸条，以45。左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，程建费用多余的纸条折叠打绩，不使散开，幸运上量度，辛苦干支扎成一爽，窒电热子燥辍学，于16号主2C灭茵约。6.4 采祥瓶的灭菌将洗净并烘干后的1OOOmL磨口试Ji!J瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中，于160士2C灭茵沁。6.5 硫代硫酸锅灭蔼将琉代硫酸销放入无商箱(室)内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，灭菌30mino7 ;IJ
6、定步骤7.1 水样的采集7. 1. 1 F目光前采祥瓶采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶内要留下足够的空间，以备测定之前摇匀。7. .2 辛苦采集的水中有余氛，应在采样前，在无菌操作下，于元菌采样瓶(6.4)中加入5吃过菌的硫代硫528 GB/T 14643.6吨93酸纳(6.5).加入的量为每升水样约O.lgo7. 1- 3 水样采集后立即进行自由l定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中.4-10C保存，存放时间不宜越过24h。经冷冻保存后的水样簿测定时，从冰箱中取出，30C发布活化4-5h.再进行测定。7.2 无蕾靠在室灭离把试验所用的无菌培
7、养葱、无茵稀释水、无菌吸营等Il品放入无菌箱室)内，打开紫外线灯灭菌30mln。7.3 水样的稀释和接种7. 3. 1 水样放入灭过茵的无黯籍(窒)(7.幻中，立即后75%(V/V)乙醇溶液的医用脱Bil掷球擦子，点燃无菌籍(窒)内的酒椅上了。7.3.2-7.3.6的操作应在无菌箱(室内的火焰区进行。7. 3. 2 选择适宜的稀释度，成使最后一个稀释度接种培养后无铁细菌生长，在空白稀释水样瓶(6.2)上标上稀释度数。7.3.3 Jfjl0倍稀释法草草军事水样，那黑5mL无离吸管(6.3)吸取5四L水样注入到45mL空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10币107. 3. 4 另取民支5rnL无菌
8、吸管吸取5rnL稀释度为10-1水样注入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为102，依次类推，1n臣需要的稀释度为止e7.3.5 将水辛辛包括稀释水辛辛分别接种子装有培养基的试管中(6.1)，试智囊试管架上，每个事罪释度重复接种5管根据需要也1lJ:重复接种3管或4管)，每管按手中lmL，每接一个稀释度更换一文无蕾吸管。7. 3. 6 另取一组试管培养基(6.1)不接水样，作为空白。7.4 培养在生化培养箱中29士lC培养14d。8 计数与报告8. 1 凡产生褐色或黑色沉淀且原培养基中棕色消失变为透明状者，表明有铁细菌存在，以+(阳性)表示，其余试管以-(阴性)表示。8. 2 如果空鼠也褒
9、限诠反应，表磅测定过军革中有污染，本次泌定无效。8.3 算出10进位稀释管中阴性试管数，以阳性组合指数记录下来。8.4 在10进位稀释中多于三个稀释度时，限性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出限性组合指数见表倒L2、4)。8. 5 若依然8.4所规定的原则选出三个稀释度后，有更高前草草释仍然产生一个!la性试管，就应该将这一个阳性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中(见表1例3)。8. 6 根据阳性组合的指数，资表(附录A)得出最大可能的商数(MPN)除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，
10、即为每毫升水样中铁细菌的德数(如果每个稀释度重复接章中4管或3管，根据阳性组合的指数蜜附录B表Bl或吉普法C表Cl)。529 GB/T 14643.6-93 例表稀释度、生长情况及阳性试管数阳性组合指数报告方式例次个/mL10-2 10-3 10-4 10 10-1 十十十+十十十一一一一-一5.0/10 -, 50 520 2 。5 5 +十十+十一一一一-25/1025 十十+542 。4 2 。5 十十+十十一+一十-532 14/10 14 3 3 l I 。5 +十卡+十十+十个十+一510 3. 5/JO- 3. 5 X 10 4 5 5 l l 。9 精密度9. 1 由于微生物是
11、不稳定的，精确的试验不能实现，精密度的表达仅能按MPN程序。9.2 在样品中细菌的分布是不规则的，有时细菌成倍地吸附到小颗粒上.MPN正确度随着平行管的增加而增加，当使用5个平行管，每管加lmL祥品时，测定结果的置信度为95%.530 指数个/mL指数000 0.0 203 001 0.2 210 002 0.4 211 010 0.2 212 011 。.4 220 012 O. 6 221 020 O. 4 222 021 0.6 230 03 1) O. 6 231 1归)O. 2 240 101 0.4 300 102 O. 6 301 103 0.8 302 110 0.4 310
12、111 O. 6 311 112 0.8 312 120 O. 6 313 121 O. 8 320 122 1. 0 321 130 0.8 322 I:H 1. 0 330 141 1. 1 331 200 O. 5 340 2111 O. 7 341 202 O. 9 350 GB/T 14643.6-93 附录A五个平行管最大可能的菌数(补充件)表Al个/mL指数1. 2 400 O. 7 401 0.9 402 1. 2 403 0.9 410 1. 2 411 1. 4 412 1. 2 420 1. 4 421 1. 4 422 0.8 430 1. 1 431 1. 4 432
13、 1. 1 440 1. 4 441 1. 7 450 2.0 451 1. 4 500 1. 7 501 2.0 502 1. 7 503 2.0 504 2. 0 510 2. 5 511 2. 5 512 个/mL指数个/mL1. 3 513 8. 5 1. 7 520 5. 0 2.0 521 7.0 2. 5 522 9. 5 1. 7 523 12. 0 2. 0 524 15. 0 2. 5 525 17.5 2.0 530 8.0 2. 5 531 11. 0 3.0 532 14. 0 2. 5 533 17. 0 3.0 534 20.0 4.0 535 25.0 3. 5
14、 540 13.0 4. 9 541 17. 0 4.0 542 25. 0 5. 0 543 30.0 2. 5 544 35.0 3.0 545 45.0 4.0 550 25.0 6. 0 551 35.0 7. 5 552 60.0 3. 5 553 90.0 4. 5 554 160.0 6. 0 555 180.0 531 指数个/mL指数000 o. 0 113 001 o. 2 120 002 o. 5 121 003 O. 1 122 。10o. 2 123 011 O. 5 130 。12O. 1 131 013 O. 9 132 020 O. 5 140 021 O. 1
15、 141 022 O. 9 200 030 o. 7 201 031 O. 9 202 040 o. 9 203 011 1. 2 210 100 O. 3 211 101 O. 5 212 102 0.8 213 103 1. 0 220 110 O. 5 221 111 O. 8 222 112 1. 0 230 532 GB/T 14643.6-93 附录B四个平行时管最大可能菌徽(补充件)表B1个/mL指数1. 3 231 0.8 240 1. 1 241 1. 3 300 1. 6 301 1. 1 302 1. 4 303 1. 6 310 1. 4 311 1. 7 312 o.
16、 6 313 0.9 320 1. 2 321 1. 6 322 O. 9 330 1. 3 331 1. 6 332 2. 0 333 1. 3 340 1. 6 341 2.0 400 1. 7 401 个/mL指数个/mL2.0 402 5.0 2.0 403 7.0 3.0 410 3. 5 1. 1 411 5. 5 1. 6 412 8.0 2.0 413 11.0 2. 5 414 14.0 1. 6 420 6. 0 2.0 421 9. 5 3.0 422 13.0 3.5 423 11. 0 2.0 424 20.0 3.0 430 11. 5 3.5 431 16.5 3
17、.0 432 20.0 3.5 433 30.0 4.0 434 35. 0 5.0 440 25.0 3.5 441 40.0 4.5 442 70.0 2.5 443 140.0 3.5 444 160.0 指数个/mL000 0.0 001 0.3 010 0.3 011 0.6 020 0.6 100 。.4 101 0.7 102 1. 1 110 O. 7 111 1. 1 120 1.1 121 1. 5 130 1. 6 200 0.9 附加说明.G8/T 14643.6-93 附录C三个平行管最大可能的菌数补充件)表Cl指数个/mL201 1. 4 202 2.0 210 1
18、. 5 211 2.0 212 3.0 220 2.0 221 3.0 222 3.5 223 4.0 230 3.0 231 3. 5 323 4.0 300 2. 5 301 4.0 本标准由中华人民共和国化学工业部提出。本标准由化学工业部天津化工研究院归口.本标准由南京大学和南京中山水处理公司负责起草。本标准主要起草人曾昭琪、丁美芳、解正宽、蒋振祥。指数个/mL302 6. 5 310 4. 5 311 7. 5 312 11.5 313 16. 0 320 9.5 321 15.0 322 20.0 323 30.0 330 25.0 331 45.0 332 110.0 333 140.0 533
