1、ICS 11220B 41 缮园中华人民共和国国家标准GBT 1 799952008代替GBT 179994 1999SPF鸡 微生物学监测第5部分：SPF鸡 琼脂扩散试验SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 5：Agar gel precipitation test for SPF chicken20081231发布 20090501实施宰瞀嗽紫瓣警襻瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“刖 昌GBT 1799952008GBT 17999(SPF鸡微生物学监测分为10个部分：第1部分：SPF鸡微生物学监测总则；第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑
2、制试验；第3部分：SPF鸡血清中和试验；第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验；第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验；第7部分：SPF鸡胚敏感试验；第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验；第9部分：SPF鸡试管凝集试验；第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。本部分为GBT 17999的第5部分。本部分修订参照了GBT 18936 2003(高致病性禽流感诊断技术、NYT 540 2002鸡病毒性关节炎琼脂凝胶免疫扩散试验方法、NYT 556 2002(鸡传染性喉气管炎诊断技术、OIE(陆生动物(哺乳动物、禽鸟和蜜蜂)诊断试验和疫苗手册(第五版)中的有关规定。本部分代替G
3、BT 179994-1999SPF鸡琼脂扩散试验。本部分与GBT 1 79994 1999相比主要变化如下：-增加了加样示意图、结果判定示意图以示说明；增加了附录A“马立克氏病病毒抗原琼脂扩散检验的程序”；增加了附录B“试剂的配制”。本部分的附录A、附录B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SACTC 181)归口。本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。本部分主要起草人：曲连东、姜骞、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、刘家森、司昌德、郭东春、于海波、孟庆文。本部分所代替标准的历次版本发
4、布情况为：GBT 1799941999。1范围SPF鸡微生物学监测第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验GBT 1799952008GBT 17999的本部分规定了琼脂扩散试验的技术要求。本部分适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血清抗体检测：禽流感病毒(Avian InfluezaVirus)、传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)、传染性法氏囊病病毒(Infectious BursaDiseaseVirus)、传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus)、禽痘病毒(Fowl PoxVirus)、禽脑脊髓炎病毒(Av
5、ian Encephalomyelitis Virus)、网状内皮增生症病毒(RetieuloendotheliosisVirus)、禽呼肠孤病毒(病毒性关节炎)(Avian Reovirus)、马立克氏病病毒(MarekS Disease Virus)、禽腺病毒I群(AvianAdenovirusGroup I)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)。本部分同样适用于对SPF鸡进行马立克氏病病毒(MarekS Disease Virus)抗原的检测(见附录A)。2原理抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中，可以向四周自由扩散，二者互相结合，在最适比例处出现沉淀线。采用已知抗
6、原检测相应的抗体，或已知抗体鉴定相应的抗原。3试剂和材料31试剂311琼扩抗原或抗体。312标准阳性血清。313被检血清或羽髓。314 001 molL、pH72的8氯化钠磷酸盐缓冲溶液(见附录B)。315 001 molL、pH64的8氯化钠磷酸盐缓冲溶液(检测禽流感病毒抗体时使用，见附录B)。316优质琼脂粉或琼脂糖。32材料琼扩板，打孔器，移液器。4操作程序41琼脂板制备将l g优质琼脂粉或08 g10 g琼脂糖加入100mL的001molL、pH72的8氯化钠磷酸缓冲液中(检测禽流感病毒抗体时使用)，水浴加热融化，稍凉(6065)，倒人琼扩板内(厚度为3 ram)，待琼脂凝固后，4冰箱
7、保存备用。42打孔用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径3 mm4 mm，孔距3 mm。用8号针头挑出孔内琼脂，挑出时从孔一侧边缘插入针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向上挑出。43封底用酒精灯轻烤平皿底部至微融化，以防侧漏。44加样用移液器吸取抗原悬液，滴人中间孔(图1中的号孔)，周围、号孔加阳性血清，其余孔加被检GBT 1799952008血清，每孔均以不溢出为度，每加一个样品应换一个枪头。 一囤1琼脂扩散结果45感作将琼扩板加盖保湿，放于37温箱内作用24 h72 h，观察沉淀线。5结果判定51判定方法将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清(图1中的和号孔)与抗原孔之间出
8、现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。52判定标准521 阳性结果：被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰的沉淀线，且该线和抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合。522弱阳性结果：被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清(如图1中号孔)的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性(凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性)。523阴性结果：被检血清(如图1中的号孔)孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。被检血清孔(图1中的号孔)与中心抗原孔之间的沉淀线粗而混浊或标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，则被检血清孔为非
9、特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。524介于阴性、阳性之间为可疑。可疑应重检，仍为可疑判为阳性。2附录A(规范性附录)马立克氏病病毒抗原琼脂扩散检验的程序A1材料A11抗原和标准阳性血清。A12溶液：pH74、001 molL磷酸盐缓冲液；1硫柳汞溶液；生理盐水。A13琼脂板。A2操作方法GBT 1799952008A21打孔A211在已制备的琼脂板上，用直径4 rnm或3 mm的打孔器按六角形图案打孔，或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔距离为3 mm。A212将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向挑出，勿损坏孔的边缘，避免琼脂层脱离平皿底部。A213用酒
10、精灯火焰轻烤平皿底部至琼脂轻微融化为止，封闭孔的底部，以防样品溶液侧漏。A22加样用微量移液器吸取用灭菌生理盐水稀释的标准阳性血清(按产品使用说明书的要求稀释)滴人中央孔，标准阳性抗原悬液分别加入外周的第1孔、第4孔中，在外周的第2、3、5、6孔处按顺序分别插入被检鸡的羽毛髓质端(长度约05 cm)；或在第2、3、5、6孔中加入被检的羽髓浸出液，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。A23感作加样完毕后，静止5 min10 min，将平皿轻轻倒置，放入湿盒内，置于37温箱中反应，分别在24 h和48 h观察结果。A3结果判定及判定标准A31将琼脂板置于日光灯或侧强光下进行观察，当标
11、准阳性血清孔与标准抗原孔间有明显沉淀线，而标准阳性血清孔与待检抗原孔之间也有明显沉淀线，且此沉淀线与标准抗原孔和标准血清孔间的沉淀线末端相融合，则待检样品为阳性。A32当标准阳性血清孔与标准抗原孔的沉淀线的末端在比邻的待检抗原孔处的末端向中央孔方向弯曲时，待检样品为弱阳性。A33当标准阳性血清孔与标准抗原孔间有明显沉淀线，而待检抗原孔与标准阳性血清孔之间无沉淀线，或标准阳性血清孔与抗原孔间的沉淀线末端向比邻的待检抗原孔直伸或向外侧偏弯曲时，该待检血清为阴性。A34介于阴性、阳性之间为可疑。可疑应重检，仍为可疑判为阳性。GBT 1799952008附录B(规范性附录)试剂的配制B1 001 molL、pH72(pH64)的磷酸盐缓冲溶液氯化钠磷酸二氢钠磷酸氢二钠(Naz HPOt12HzO)氯化钾调pH至加蒸馏水至8 g02 g29 g02 g72(pH64)1 000 mL112 kPa、20 rain高压灭菌，4保存备用。B2 001 molL、pH72(pH64)的8氯化钠磷酸盐缓冲溶液4向100 mL 001 molL、pH72(pH64)的磷酸盐缓冲溶液中加入8 g氯化钠。参考文献1GBT 18643-2002鸡马立克氏病诊断技术GBT 17999520085
