1、ICS 11. 220 B 41 量中华人民共和国国家标准GB/T 21674-2008 猪圈环病毒聚合酶链反应试验方法Detecting porcine circovirus with polymerase chain reaction 2008-04-09发布2008-06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总届世世中国国家标准化管理委员会。叩前本标准附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位=农业部兽医诊断中心。-= F司本标准主要起草人z田克恭、玉宏伟、孙明、王传彬、陈西钊。G/T 21674-2008 I G
2、BjT 21674-2008 I tE 猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒I型(porcinecircovirus typel , PCV-l)和有致病性的猪圆环病毒E型(porcinecircovirus type2，PCV一2)0PCV号是引发仔猪断奶后多系统衰弱综合征(post-weaningmultisystem wasting syndrome，PMWS)的主要病原。该病主要以J患畜生长迟缓、进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，给世界各国主要养猪地区的规模化养猪业造成了一定的经济损失。E G/T 21674-2008 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法1 范自本标准
3、规定了猪圆环病毒(PCV)聚合酶链反应(PCR)检测i方法的技术要求。本标准适用于猪血清和组织中的猪圆环病毒检测，以及其I型(PCV-l)和E型(PCV-2)的鉴别。2 实验室生物安全要求试验操作应在生物安全E级(BSL-2级)以上的实验室进行。3 实验材料、仪器设备和试剂3. 1 实验材料眼科剪、眼科银、称量纸、10mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500mL锥形瓶、吸头(10L、200L、1000L)、灭菌双蒸水。3.2 仪器设备分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮罐或
4、一70.C冰箱、微波炉、组织研磨器、20.C冰箱、水洛锅、可调移液器(最大量程为2L、20L、200L、1000L)。3.3 试剂本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。3.3. 1 消化液(见第A.1章)。3.3.2 2%蛋白酶K溶液(见第A.2章。3.3.3 盼-三氯甲烧-异戊酶混合液(见第A.3章)。3.3.4 2.5 mmol/L dNTP(见第A.4章。3.3.5 10 pmol/LPCV引物见第A.5章。3.3.6 0.5 U/LTaqDNA聚合酶(见第A.6章曰3.3.7 10倍PCR缓冲液(见第A.7章)。3.3.8 澳化乙绽(EB)溶液(见第A.8章)。3.3.9 电泳缓冲
5、液(50倍)(见第A.9章)。3.3. 10 1%琼脂糖凝胶(见第A.10章3.3. 11 上样缓冲液(见第A.ll章。3.3. 12 异丙醇。3.3.13 75%乙障(见第A.12章。3.3. 14 15 mmoL/L氯化续(见第A.13章)。3.3.15 灭菌双蒸水(见第A.14章。3.3. 16 电泳缓冲液(1倍)(见第A.15章。4 操作程序4. 1 样晶的采集与处理4. 1. 1 祥品的采集z濒死猪、扑杀的成年猪和流产胎儿取肺脏和淋巴结g幼龄猪取心脏;待检活猪，用注射器取血2mL4 mL，立即送往实验室。1 GB/T 21674-2008 4.1.2 样品的处理:每份样品分别处理4.
6、 1. 2. 1 组织样品处理z取待检病料约0.2g置研磨器中剪碎并研磨，加人2mL消化液(3.3.1)继续研磨。取己研磨好的待检病料上清100L.置1.5 mL灭菌离心管中，再加入500L消化液(3.3.1)和10L2%蛋白酶K溶液(3.3.2)，混匀后，置55C水浴中4h16 ho 4. 1. 2. 2 血清样品处理:待血液凝固后，取上清放于离心管中，4C8000 g离心5mn，取上清100L，置1.5 mL灭菌离心管中，加入500L消化液(3，3，1)和10L2%蛋白酶K溶液(3，3.2)，混匀，置55C水浴中4h16 h。4,1. 2, 3 阳性对照处理z分别取PCV-1管加入500L
7、消化液(3，3.1)和4, 1. 2. 4 阴性对照处理g10L2%蛋白酶K溶液(3，4, 2 DNA模板的提取70C冰箱中304, 2.3 弃上清，转洗一次后倒掉2L，t昆匀，条件为94C30 4.4 电泳5 结果判定当PCV-1阳性对照出现目的带时，实验结果成立。阳性，未出现相应扩增带的样品判为2 100L，置1.5 mL灭茵离心管中，每，置55C水浴中4h16 ho 加入500L消化液(3，3.1)甲烧-异戊薛混合液中3min或3)溶液，轻轻旋5)、15mmol/L L，DNA模板物油)。扩增扩增带，阴性对照未出现1 154 bp扩增带为PCV-2A.1 消化液A. 1. 1 1 mol
8、/L三瓷甲基氨基甲炕-盐三泾基甲基氨基甲烧灭菌双蒸水浓盐酸灭菌双蒸水A. 1.2 0.5 mol/L 二水乙二钱四灭菌双蒸水氢氧化销A.4 灭菌双蒸水蛋白酶K(分析纯灭商双蒸水碱性盼三氯甲烧异戊晖2.5 mmol/L dNTP dATPOOO mmol/L) dTTPOoO mmol/L) dGTPOOO mmol/L) dCTP(lOO mmol/L) 灭茵双蒸水附录A(规范性附录试剂的配制25 mL 24 mL 1 mL 20L 20L 20L 20L 加至800LGB/T 21674-2008 3 GB/T 21674-2008 A. 5 10 pmol/,.L PCV引物引物序列=P1
9、,5-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3 P, , 5 -CTCGGCTA TGCGCTCCAAAATG-3 P3,5-ACCCCCGCCACCGCTACC-3 上游引物P1(2 ODo)加入375.4L灭菌双蒸水溶解，下游引物P，(2 OD260)加入326.6L灭菌双蒸水溶解，下游引物P3(2 ODo)加入401.9L灭菌双蒸水溶解，分别取P1、P，、P，溶液各300L，混匀即为10pmol/LPCV引物。A.6 0.5 U/,.L Taq DNA聚合酶5 U Taq DNA聚合酶灭菌双蒸水现用现配。A.7 10倍PCR缓冲液A. 7.1 1 mol/L三娃甲基氨基甲炕-盐酸(Tr
10、is-HCL)(pH9. 0) 短基甲基氨基甲炕(分析纯)灭菌双蒸水浓盐酸(分析纯)灭菌双蒸水A. 7. 2 10倍PCR缓冲液1 mol/L三起甲基氨基甲烧盐酸(Tris-HCL)(pH9. 0) 氯化饵(分析纯)曲拉通X-I00(分析纯灭商双蒸水A.8 澳化乙绽(EB)溶液澳化乙镀双菌双蒸水A.9 电泳缓冲液(50倍)A. 9. 1 O. 5 moI/L乙二镀阳乙酸二锅(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二钱四乙酸二销(分析纯)灭菌双蒸水氢氧化纳灭菌双蒸水A.9.2 TAE(三搓甲基氨基甲娩-z酸电泳缓冲液(50倍)瓷基甲基氨基甲炕(Tris)(分析纯)4 冰乙酸。.5mol/L乙二续四乙
11、酸二锅溶液(pH8.0)灭菌双蒸水用时用灭菌双蒸水稀释使用。1L 加至10L15.8 g 80 mL 调pH至9.0加至100mL 1 mL 0.373 g 0.1 mL 加至100mL 0.2 g 加至20mL 18.61 g 80 mL 调pH至8.0加至100mL 242 g 57.1 mL 100 mL 加至1000mL GB/T 21674-2008 A.10 1 %琼脂糖凝胶琼脂糖(电泳级)2 g TAE电泳缓冲液(50倍)4 mL 灭菌双蒸水196 mL 微波炉中完全融化，加澳化乙键(EB)溶液20L，A. 11 上样缓冲液澳盼蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g藤糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的澳盼蓝溶液中，摇匀定容至100mL, A.12 75%乙醇无水乙醇(100%)(分析纯灭菌双蒸水A.13 15 mmoI/L氯化簇氯化续(分析纯灭菌双蒸水A.14 灭菌双蒸水750 mL 250皿L0.143 g 100 mL 1000 mL双蒸水(电阻二三18.20)，放于高压锅中，121C高压20min后取出备用。A.15 电泳缓冲液(1倍电泳缓冲液(50倍)灭菌双蒸水10 mL 490 mL 5
