1、ICS 65.020.30 B 43 每昌中华人民主t/、和国国家标准GB/T 25879-2010 鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法Determination of lysozyme in chicken egg white一Spectrophotometry 2011-01-10发布2011-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法GB/T 25879-2010 峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出
2、版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张0.5字数8千字2011年2月第一版2011年2月第一次印刷4陪书号:155066. 1-41602定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 25879-2010 目。吕本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:扬州大学动物科学与技术学院。本标准主要起草人:王金玉、谢皑舟、戴国俊、侯启瑞、刘大林。I 1 范围鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法本标准规定了鸡蛋蛋清中溶菌酶的分光光度测定方法。本标准适用于鸡蛋蛋
3、清中溶菌酶含量和活力的测定。2 规范性引用文件GB/T 25879-2010 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 蛋清egg时lite位于鸡蛋蛋壳内膜和蛋黄膜之间的半流动肢体物质。3.2 溶菌酶Iysoz严ne一种专门作用于微生物细胞壁的糖背水解酶。4 鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的测定4.
4、 1 原理溶菌酶在281nm被长处有最大吸收峰。溶菌酶标准品用每升溶液含9g氧化铀的溶液溶解并稀释成不同梯度浓度，在281nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程。试样经过处理，按溶菌酶标准品测定方法，测定试样中的吸光度，根据其吸光度值由标准曲线回归方程计算试样中溶菌酶含量。4.2 仪器4.2.1 紫外-可见分光光度计(波长范围190nm饲onm，波长确定d性士0.3nm，波长重复精度:l:0.1nm)。4.2.2 电子分析天平(感量0.1mg, l mg)。4.2.3 离心机(最大离心力2325g，具10mL离心管)。4.3 试剂与材料4.3.1 榕菌酶标准品，优级纯，活力在
5、20000 U/mg左右。4.3.2 氧化铀，分析纯。4.3.3 蒸馆水，按GB/T6682执行。4.3.4 医用脱脂纱布。4.4 试剂配制4.4.1 0.9%氯化铀溶液z称取氯化铀(4.3.2)0.9g，溶解于蒸馆水中，定容至100mL。1 GB/T 25879-2010 4.4.2 溶菌酶标准工作液:称取溶菌酶标准品(4.3.1)0.500g，以0.9%氧化铀溶液(4.4.1)溶解定容至1000 mL，得到500g/mL的溶菌酶标准工作液，于4oc密封保存备用，1周内使用。4.5 分析步骤4.5.1 标准曲线的绘制分别吸取溶菌酶标准工作液(4.4.2)1mL、2mL、3mL、4mL、5mL
6、于25mL容量瓶中，以0.9%氯化铀溶液(4.4.1)稀释至刻度，混匀。用10mm石英比色皿比色，以0.9%氧化铀溶液(4.4.1)为参比溶液，在波长281nm处依次测定各标准工作液的吸光度，以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出标准曲线回归方程。4.5.2 试样测定鸡蛋蛋清用4层纱布过滤，取过滤试样1mL，用0.9%氧化铀溶液稀释定容至100mL，混匀，避免起泡沫。吸取5mL蛋清的氯化铀溶液，1310g离心5min，取上清液，按照绘制标准曲线的操作步骤(4.5.1)，在波长281nm处测定试样溶液的吸光度。平行测定三次，取结果的算术平均值，由标准曲线回归方程计算试
7、样溶液中溶菌酶的浓度。4.6 结果的计算与表述根据试样溶液吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度c。鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量按式(1)计算zX=cX击式中:X一一鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量，单位为微克每毫升(g/mL); C一一试样溶液中溶菌酶的浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V一一试样溶液定容的体积，单位为毫升(mL); V1一一试样的体积，单位为毫升(mL)。4. 7 精密度、准确度、灵敏度4.7.1 精密度本方法检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的批内变异系数CV:3%，批间变异系数CV5%。4.7.2 准确度鸡蛋蛋清溶液中添加溶菌酶标准品浓度在20g/mL60g/mL范围内，回收
8、率注95%。4.7.3 灵敏度本方法检测鸡蛋蛋清溶液中榕菌酶含量的最低检测限为0.3g/mL。5 鸡蛋蛋清中溶菌酶活力的测定5. 1 原理. ( 1 ) 溶菌酶通过榕解G+菌的细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低。酶的活力表示为在特定条件下单位时间内转化底物的速度。本标准根据该原理，以溶壁微球菌为底物，用分光光度法，以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据，测定溶菌酶的活力。5.2 仪器5.2.1 紫外-可见分光光度计(波长范围190nm900 nm，波长确定d性士0.3nm，波长重复精度士0.1nm)。5.2.2 电子分析天平(感量0.1mg、1mg)。5.2.3 摇
9、床(控温范围ooC10o oC，转速振幅:0r旷/min户、斗.乌、白、-5.2.4 pH计(精密度土0.01)。5.2.5 离心机(最大离心力2325g，具10mL离心管)。5.2.6 高压灭菌锅。5.2.7 超低温冰箱。5.3 试剂与材料5.3.1 氯化铀，分析纯。5.3.2 甘油(丙三醇)，分析纯。5.3.3 磷酸氢二铀，分析纯。5.3.4 磷酸二氢锅，分析纯。5.3.5 牛肉霄，生化试剂。5.3.6 蛋白陈，生化试剂。5.3.7 酵母提取物，生化试剂。5.3.8 琼脂，生化试剂。5.3.9 溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus Fleming)。5.4 试剂配制
10、与培养基制备GB/T 25879-2010 5.4. 1 0.9%氧化铀溶液:称取氯化铀0.9g，溶解于蒸馆水中，定容至100mL, 121 oC高压灭菌30 min 。5.4.2 20%甘油(丙三醇)溶液z称取甘油20.0g，榕解于蒸馆水中，定容至100mL, 121 oC高压灭菌30 min 。5. 4. 3 o. 2 mol/L pH6. 2磷酸盐缓冲液:称取磷酸氢二铀(Na2HP04 12H2 0) 71. 63 g，用蒸馆水溶解定容至1000 mL;称取磷酸二氢铀(NaH2P04 2H2 0)33.00 g，蒸锚水溶解并定容至1000 mL。取Na2HP04溶液18.5mL与NaH2
11、P04溶液81.5 mL混合，混匀即可。5.4.4 固体培养基:牛肉膏0.3g、蛋白陈1.0g、氧化铀0.5g溶解于100mL水中，各组分溶解后，加入琼脂2.0g，持续搅拌至琼脂完全溶解，用1mol/L氢氧化铀调整pH至7.27.4，并用水定容至100 mL，分装在试管里，每管液量为15mL20 mL，加棉花塞，121oC高压灭菌30min后，倒入培养皿中加盖，冷却至室温。5.4.5 液体LB培养基z蛋白陈1.0g、酵母提取物0.5g、氧化铀1.0g溶解于100mL水中，用1mol/L 氢氧化铀调整pH至7.27. 4，分装在试管里，121oC高压蒸汽灭菌30mino 5.5 分析步骤5.5.
12、1 菌液的制备将溶壁微球菌(5.3.9)先接种于灭菌的固体培养基(5.4.4)中活化和扩大培养，再接种于灭菌的液体LB培养基(5.4.5)中，37oC摇床培养至菌体增殖，培养9h10 h，将培养液1310 g离心10min，收集沉淀的菌体。该菌体加入3倍体积灭菌的0.9%氧化纳溶液(5.4.1)悬浮，1310 g离心10min，收集沉淀的菌体，重复4次5次。再用20%甘油溶液(5.4.2)将菌体制成薪稠状，置于一60oC保存，半年内使用。使用前，用磷酸盐缓冲液(5.4.3)溶解溶壁微球菌，调至OD45Q吸光度值范围在1.21.4，2oC 8 oC放置。5.5.2 鸡蛋蛋清溶液的制备鸡蛋蛋清用4
13、层纱布过滤。取过滤试样1mL，用磷酸盐缓冲液(5.4.3)定容至100mL, l 310 g离心5min除去不溶物。5.5.3 试样测定按4.5的方法，在281nm波长处测定鸡蛋蛋清溶液的吸光度，并计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c。鸡蛋蛋清溶液、菌液于25oC水浴中保温，在450nm波长处测定酶活力，试样测定反应体系见表1。2日|h山NH阁。GB/T 25879-2010 试样测定反应体系加入物测定液/mL空白液/mL鸡蛋蛋清溶液O. 2 0.0 菌液1. 0 0.0 磷酸盐缓冲液CpH6.2)O. 0 1. 2 表1用空白液调零，加0.2mL鸡蛋蛋清溶液到10mm石英比色皿中，从加入1.0 mL
14、菌敲开始计时，记录在450nm波长处反应15s和75s时的读数为AI、儿。按每分钟OD450值下降0.001为一个活力单位(U)的定义，鸡蛋蛋清中溶菌酶的活力按式(2)计算:EA = -=-. - 0.001 X Ew . ( 2 ) 式中:EA 鸡蛋蛋清中溶菌酶活力，单位为单位每毫克(U/mg); t:.E450 -在两时间点测定的吸光度AI、A2之差;Ew-0.2 mL鸡蛋蛋清溶液中含有溶菌酶的质量，单位为毫克(mg)。0.2 mL鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶的质量Ew与试样溶液中溶菌酶的浓度c之间的关系按式(3)计算:. ( 3 ) flu 一-nu ?三-1i nu-E 重复性在相同条件下获得的三次独立测试结果的变异系数CV:10%。5.6 侵权必究书号:155066.1-41602定价:14.00 JG 峰版权专有打印日期:2011年3月23日F002AG8/T 25879-2010
