1、ICS 65.020.30 B 43 远昌中华人民共和国国家标准GB/T 25887-2010 奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法Method of PCR-RFLP for detecting complex vertebral malformation in dairy cattle 2011-01-10发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2011-06-01实施发布目。吕本标准的附录B为规范性附录，附录A、附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:华中农业大学。本标准主要起草人
2、:张淑君、杨利国、李翔、胡修忠、刘文举、宋利军。GB/T 25887-2010 I 奶牛脊椎畸形综合征检测PCR-RFLP法1 范围本标准规定了奶牛脊椎畸形综合征的PCR-RFLP检测技术。本标准适用于奶牛脊椎畸形综合征的检测与诊断。2 规范性引用文件G/T 25887-2010 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下
3、列术语和定义适用于本标准。3. 1 奶牛脊椎畸形综合征complex vertebral malformation in dairy cattle; CVM 奶牛的一种常染色体隐性遗传病，主要表现为母牛流产、胎儿早期死亡、出生后不久死亡，患病棋牛主要症状表现为:颈短、脊推畸形、心脏畸形、腿部畸形、系部呈现对称的内向僵直等。3.2 SLC35A3基因SLC35A3 gene 定位于牛第3号染色体上，在基因序列数据库(GenBank)中的登录号为AY160683，全长14901bp，mRNA为981bp，由7个外显子和6个内含子组成，该基因编码核糖转运蛋白，与脊柱发育有关，是奶牛脊椎畸形综合征的致
4、病基因。3.3 限制性片段长度多态性restriction fragment length polymorphism, RFLP 检测DNA用限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。4 原理SLC35A3基因第四外显子中第559位碱基由G突变为T时，其对应编码的氨基酸由缴氨酸改变为苯丙氨酸，导致奶牛脊椎畸形综合征的发生。采用PCR-RFLP技术检测牛样本基因组DNA变异，即采用PCR技术扩增SLC35A3基因片段，限制性内切酶消化P
5、CR扩增产物，电泳检测酶切产物，对SLC35A3基因进行分型，根据基因型判定奶牛是否携带脊椎畸形综合征的致病基因。5 扩增SLC35A3基因片段的引入酶切位点PCR引物5CCACTGGAAAAACATGCTGTGAGTA 3 5 GCTCTCCTCTGT AA TCCCCA 3 预期扩增长度为225bp。1 GB/T 25887-2010 6 试剂和仪器6. 1 主要试剂水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。Taq DNA聚合酶及PCR缓冲液、Rsa1限制内切酶及10X酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量标记购自试剂公司。TE缓冲液、TAE缓冲液、TBE缓冲液、PBS缓冲液、加样缓冲液、10%
6、过硫酸镀、30%丙烯酷胶、10%聚丙烯眈胶、澳化乙镜、10%SDS、1mol/L Tris-HCl、O.5 mol/L EDT A (pH8. 0)、三甲:皖/异戊醇(24: 1)、3mol/L乙酸铺、固定液、脱色液、染色液、显影液、停显液等。具体配制方法参见附录A。6.2 主要仪器冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪、梯度PCR仪、电泳仪、凝肢成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馆水器、微量移液器a7 检测步骤7. 1 牛基因组DNA制备采用常规的酣仿拍提法提取牛样本基因组DNAo4 C冰箱中保存备用。7.2 PCR扩增及其产物检测20LPCR反应体系:0.4mol/L引物、O.2 mmo
7、l/L dNTP、待测DNA85 ng100 ng、1U Taq DNA聚合酶、10XPCR缓冲液，加适量双蒸水。可根据需要调整反应体系。PCR反应条件:94C变性3mi日，35个循环(94C30 s , 65 C 305, 72.C 30 s)，72.C延伸10min , 4 .C保温2min10 min。取2LPCR产物，2%3%琼脂糖凝胶电泳。V/cm5V/cr口，电泳20min30 min)，澳化乙链(EB)染色后，在凝胶成像系统观察条带。PCR扩增结果示意同见附录B中的图B.1.7.3 酶切及其产物检测取16LPCR扩增产物，加入5U限制内切酶Rsa1和2LIOX酶切缓冲液，力II水
8、至20L，反应条件参见产品说明书。10%12%聚丙烯酷肢凝胶电泳(3V /cm5 V/cm，电泳3h1 h)，银(染色方法参见附录C)。酶切图谱见附录B中的图B.2.7.4 结果判定由于24bp的条带太小，以致在10%12%聚丙烯酷肢凝胶电泳检测时显示不出来，但可根据225 bp、201bp条带进行样本基因型判定。2 健康奶牛:基因型为GG型，即出现201bp一条电泳带;隐性携带者:基因型为GT型，即出现225bp、201bp两条电泳带;CVM患者:基因型为TT型，即出现225bp一条电泳带。G/T 25887-2010 附录A(资料性附录)主要试剂及配制方法表A.l主要试剂及配制方法试剂配制
9、方法TE缓冲液10 mmol/L Tris-HC1(pH8. 0) , 1 mmol/L EDTA(pH8. 0) 50XTAE缓冲液212 g Tris碱，57mL冰乙酸，100mL O. 5 rnol/L EDTA(pH8. 0)，加双蒸水定容至1000 mL，使用时50倍稀释10%过硫酸镀称取1g过硫酸镀溶于8mL双蒸水，定容至10mL 5XTBE缓冲液54.0 g Tris碱，27.5g棚酸，20mL O. 5 mmol/L EDTA(pH8. 0)，加双蒸水定容至1 000 mL，使用时5倍稀释30%丙烯眈胶(丙烯就胶:甲叉300 mL双蒸水中溶解145g丙烯酌胶，5g甲叉双丙烯眈胶
10、，用双蒸水定容至双丙烯眈胶=29:1) 500 mL 10%聚丙烯酷胶量取9.3mL30%丙烯耽胶，18.5mL双茶水，7mL 5XTBE,0. 23 mL 10%过硫酸镀，0.02mL TEMED 加样缓冲液0.25%澳盼蓝(质量浓度)，40%蔚糖(质量浓度)漠化乙筷(EB)100 mL双蒸水中加入0.1EI3(lOmg/mL)，搅拌使完全溶解，转入棕色试剂瓶，锡?自包裹PBS缓冲液氯化纳8g，磷酸氢工纳1.44 g，氯化饵0.2g，磷酸二氢梆0.24g加双蒸水定容至1 000 mL，调pH值至7.0，高压灭菌，室温保存10%SDS 称取50g SDS加热溶于400mL双蒸水中，定容至500
11、mL，高压灭菌，室温保存1 mol/L Tris-HCl 称取121.4 g Tris碱溶于800mL双蒸水中，加浓盐酸调至pH8.0，定容到1000 rnL , 高压灭菌，室温保存一-一-一一一一一一一-一0.5 mol/L EDT A(pH8. 0) 称取186.1g二水乙二胶四乙酸J纳溶于800mL双蒸水中，加入氢氧化销(约20 g)调至pH8.0，定容到1000mL，高压灭菌，室温保存三氯甲炕/异戊蹲(24: 1) 量取480mL三氯甲烧，加入20mL异戊蹲，混匀3 mol/L乙酸销称取408.1 g三水乙酸纳溶于800mL双蒸水中，用乙酸调至pH5.2，加水定容至1000 mL，高压
12、灭菌，室温保存固定液450 :rnL双蒸水中加入50mL乙醇脱色液492.5 mL双蒸水中加入7.5mL浓硝酸染色液500 mL双蒸水中溶解1g硝酸银，置棕色瓶中保存显影液500 mL双蒸水中溶解15g元水碳酸锅，加入1.32 mL甲M(o.046%)，用双蒸水定容至1000mL 停显液485 mL双蒸水中加入15mL冰乙酸3 GB/T 25887-2010 4 附录B(规范性附录)SLC35A3基因PCR扩增产物及酶切产物电泳示意图M 1 2 345 300 bp-一一-200 bp-一一一一-225bp M为DNA分子质量标记;泳道15分别为5个样本的PCR扩增产物(225bp)。图B.1
13、SLC35A3基因PCR扩增产物电泳示意图1 2 3 4 5如16 7 8 9 10 225 bp- liLIL-广1bpM为DNA分子质量标记;泳道13、6、9、10为健康牛群基因型(GG型); 泳道45、7和8为隐性携带者牛群基因型(GT型)。图B.2SLC35A3基因PCR-RFLP酶切产物电泳示意图附录C(资料性附录)凝胶染色方法G/T 25887-2010 C.1 电泳完毕，取下玻璃板，小心地将凝胶从玻璃板上剥离下来，放人双蒸水中漂洗一次，然后浸人10%乙醇溶液固定5min10 min。C.2 用1%硝酸脱色3minr户、.、斗、C.3 0.2%硝酸银晃动闭光染胶1归5min2汩5m
14、in川;染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次10s) , 洗去凝胶表面残留的硝酸银溶液。C.4 在染胶盒中倒入含3%碳酸铀和微量甲醒的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。C.5 注意观察显色情况，目的条带显现清晰后立刻将凝胶转入3%的乙酸溶液，浸泡10min停显。5 OFON|hNH阁。国PCR-RFLP法华人民共和国家标准奶牛脊椎畸形综合征检测GB/T 25887-2010 中峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰印张O.75 字数10千字2011年2月第一次印刷开本880X12301/16 2011年2月第一版16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价* 1S号:155066. 1-41610 GB/T 25887-2010 打印日期:2011年3月20fl F002A
