1、咱. ICS 13.300; 13.020 A 80 中华人民共和国国家标准GB/T 30664-2014 化学品两栖动物变态试验Cbemicals-Ampbibian metamorphosis assay 2014-12-31发布2015回04-30实施/阳飞中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局俗世吟地附中国国家标准化管理委员会。叩 GB/T 30664-2014 目次前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v 1 范围2 规范性引用文件. . 3 缩略语4 方法原理. . . . . . . . . . . . .
2、 . . . . . . . . . . . . . 1 5 方法说明. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5.1 试验物种. . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5.2 设备和用品. . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 5.3 化学品可检测性. . . . . . . . . . . . . . . . 2 5.4 暴露系统. . . . . . . . . . . . . 3 5.5 水质. . . . . . . . . . . 3 5.6 试验用水中的腆化物浓度
3、. . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5.7 动物饲养. . . 3 5.7.1 成体饲育. . . . . . . . . . . . . 3 5.7.2 蝴蚂饲养和选择. . . . . 4 5.7.3 蝴虫lt的培养和喂食. . . . . . . . 4 5.8 分析化学. . . 5 5.9 化学品输送. . . . . . . . . . . . . . 5 5.10 试验浓度选择. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 6 试验步骤. 6.1 试验开始和进行. . . . . . . . . . .
4、6 6.2 观察. . . . . . 7 6.2.1 一般说明 . . 7 6.2.2 第7天测量. . . . . . . . . . 7 6.2.3第21天测量(试验终止). . . . . . . . . 7 6.3 生物学终点的测定. . . . . . . . 8 6.4 终点指标. . . . . . . . . . . . . . . . 8 6.4.1 一般说明. . . . . . . . . . . . . . 8 6.4.2 发育阶段 . . . . . 8 6.4.3 HLL . . . . . . . . . . 9 6.4.4 体长和湿体重. . . . . .
5、. . . . . . . . . . . . . . 9 6.4.5 甲状腺组织学. . . . . . . . 9 6.4.6 死亡. . . . . . . 10 6.4.7 更多观察. . . . . . . 10 7 数据和报告. . . . 10 7.1 数据采集. . . . . . . . . . . . 10 7.1.1 试验物质. . . . . . . . 10 GB/T 30664-2014 7. 1.2 试验条件7. 1.3 结果. . . . . . 10 7.1.4 数据报告. . . . . 10 7.2 性能标准和试验可接受性/有效性7.3 试验有效性. .
6、. . . . 11 7.4 进行AMA的判定逻辑. 7.4.1 AMA的判定逻辑流程. . . 11 7.4.2 提前发育通过发育阶段、SVL和HLL判定7.4.3 不同步发育用发育阶段标准判定. . 7.4.4 组织病理学. 7.4.5 发育延迟(用发育阶段、HLL、身体湿重、SVL判定) . 13 7.5 统计分析. 7.6 特殊数据分析考虑. 7.6.1 有不良影响试验浓度的使用. 7.6.2 禧剂对照. 7.6.3 达到60及更高发育阶段的处理组 . 附录A(资料性附录)21天两栖类变态试验的试验条件附录B(资料性附录原始数据和总结数据报告表. . . . 18 附录c(资料性附录)
7、有一个或更多浓度的后期发育鹏蚂数超过20%时的体重和体长分析备选方法参考文献. . . . . 30 图151阶段非洲瓜瞻蠕斟的后肢形态 . . 7 图2非洲爪瞻鹏蝇的体长测量和HLL测量. . . . . 9 图3进行AMA的判定逻辑. . . . . . . . 12 图4连续效应数据的统计检验方法流程图. . . . 15 表1流水条件下AMA非洲爪瞻蟠蚂生存期间喂食方案. . . . . 4 表2根据Neuwkoop和Faber指导的突出形态学阶段标志. . . . . 6 表3AMA主要终点的观察时间点. . . . 8 表4AMA的性能标准 . . . . 11 表A.121天两栖
8、类变态试验的试验条件. . . . . 17 表B.1受试化学品的一般信息. . . . . . . . . . . 18 表B.2第7天和第21天原始数据采集表. . . . 18 表B.3第7天和第21天终点数据的计算总结. . . 21 表B.4每日死亡率数据. . . . . . . . . . . . . . . . . 22 表B.5水质标准. . . . . . . 23 表B.6化学数据总结. . . . 23 表B.7核心标准的组织病理学报告表. . . . . . 24 E . GB/T 30664-2014 表B.8其他组织病理学标准. . . . . . . . . .
9、 . . . . . . . . . . . . . 25 表B.9组织病理学结果的叙述性说明. . . . . . . . . . . . . 26 表B.10AMA第7天或第21天的总结报告表模板. . . . . . . . . . . 27 表B.11AMA第7天或第21天发育阶段数据的总结报告表模极. . . . . 28 皿GB/T 30664-2014 目。本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。- = F习本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.231(2009年H两栖动物变态测试评价英文版技术内容一致。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(S
10、AC/TC251)提出并归口。本标准起草单位z中国检验检疫科学研究院、中国科学研究院生态环境研究中心。本标准主要起草人z程艳、秦占芬、崔援、陈会明、李稀、张银凤、谢文平.V GB/T 30664-2014 化学晶两栖动物变态试验范围本标准规定了化学品两栖动物变态试验的方法原理、方法说明、试验步骤、数据和报告.本标准适用于化学品两栖动物变态测试。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。ASTM E729 用鱼类、大型无脊椎动物和两栖类动物进行受试材料急性毒性试验的
11、标准指南(Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes , macroinvertebrates, and amphibians) ASTM E1439 非洲瓜瞻胚胎致畸试验的标准指南(FETAX) Standard guide for conducting the frog embryo teratogenesis assay-Xenopus (FETAX) Nieuwkoop PD, Faber J 非洲爪瞻生长发育表(Normaltable of Xenous laevis
12、) 3 缩略语下列缩略语适用于本文件，AMA:两栖类变态试验(amphibianmetamorphosis assay)。HPT:下丘脑-垂体-甲状腺(hypothalamic-pituitary-thyroid)。SVL:口至泄殖孔的长度(snoutto vent length)。hCG:人绒毛膜促性腺激素(humanchorionic gonadotropin)。DO:溶解氧(dissolvedoxygen). MTC:最大耐受敢度(maximumtolerated concentration)。LCsQ:半数致死浓度(lethalconcentration 50)。TSH:促甲状腺激素(
13、thyroidstimulating hormone)。HLL:后肢长度(hindlimb length)。OECD:经济合作与发展组织(organisationfor economic co-operation and development)。NF:Nieuwkoop PD, Faber J (994)中对非洲爪蠕正常发育的形态学标准发育阶段分级(Nieuwkoop and Faber)。4 方法原理4.1 AMA是一项筛选试验，其用途是凭经验鉴别可能会干扰HPT轴正常功能的物质.在HPT轴保守的结构和机能的范围内，AMA代表了一种广义的脊椎动物模型方法。这是一项重要的试验，因为两栖类变态
14、是一个研究较为成熟的、甲状腺依赖性的过程，该过程对HPT轴内的活性物质有应答，并且这是目前唯一的检测形态学发青中动物甲状腺活性的试验。1 GB/T 30664-2014 4.2 试验设计一般是将51阶段的非洲爪瞻鹏斟暴露于至少3种不同被度的受试化学品和稀释用水(对照)中21天.每种试验处理设4个平行。试验开始时所有处理组的蠕蚂密度都是每个试验缸20只蝴蚂。观察终点是HLL、SVL、发育阶段、湿体重、甲状腺组织学和每日死亡率。5 方法说明5.1 试验物种非洲爪蜡在全世界的实验室里都可以常规培养，也可以通过商业渠道获得。全年均可通过注射hCG诱导使该物种繁殖，并且获得的鹏衅一般可大量饲养到所选择的
15、发育阶段，用于阶段特异性试验。该试验使用的蠕蚂最好是来源于内部成体。虽然不是首选方法，但也可以将卵或胚胎运到进行试验的实验室使其适应新的环境z但不能运送鹏斟用于试验。5.2 设备和用晶进行本试验需要以下设备和用品za) 暴露系统见5.4); b) 玻璃或不锈钢材质的鱼缸见5.4); 0 饲育缸zd) 温度控制装置如z加热器或制冷器(可以调节到22c士1C )J; d 温度计sf) 双目解剖显微镜zg) 分辨率至少为4百万像素并有微距功能的数码照相机FU 图像数字化软件Fi) Petri培养皿如100mmX15 mm)或大小相近的透明塑料盒Pj) 分析天平，精确到3位小数(mg); k) 溶氧计
16、z1) pH计zm) 光强计，能以lx为单位zn) 其他实验室用玻璃器具和工具z0) 可调式移被器(10L5000L)或各种大小相当的吸量管sp) 足量的受试化学品，最好为同一个批号Fq) 适用于受试化学品的分析仪器，或将分析服务外包.5.3 化学晶可检测性AMA的试验基础是采用流水试验方案，即通过流水系统将受试化学品引人试验容器。但是，流水法则导致受试化学品的类型受到化学品理化特性的限制。因此在使用该方案前，需了解受试化学品是否可以进行相关测试的基础信息，并参见OECD难于进行测试的物质和混合物水生毒性检测的指导文件13.表明化学品可能难以在水生系统中测试的特性包括z辛蹲水分配系数(lgKo
17、w)高、挥发性强、容易水解以及在实验室环境光照条件下容易光解。根据具体情况可能还需要考虑其他因素。如果该化学品不能使用流水系统进行试验，可以采用半静态式系统。如果这两种系统都无法测试该化学品，则不采用该试验方案。1) 参见参考文献IJ.2 GB/T 30664-2014 5.4 暴露系统在可能的情况下，流水式系统与半静态系统相比，首选前者。如果受试化学品的物理和/或化学性质不适用流水式系统，可以选用其他暴露系统(如半静态系统该暴露系统包括玻璃、不锈钢和/或聚四氟乙烯等接触水的组成部分。但在不影响研究效果的情况下也可以采用合适的塑料。暴露缸是玻璃或者不锈钢材质的鱼缸，带有储水塔，容权约为4.0L
18、 ., 10.0 L，水深最少为10cm ., 15 cm.该系统需能支持所有的暴露浓度和一个对照，每种处理设4个平行。考虑到试验动物条件的维持和化学品暴露，塔向每个缸的流速恒定如25mL/min).为了减少潜在的位置效应，包括温度、光强度等轻微差异，处理缸随机分配至暴露系统中的一个位置。使用荧光灯，光周期为12h光照:12 h黑暗，水表面处的光强度范围为600lx ,._ 2 000 lxOm/m勺。每个试验缸的水温维持在22C士1C，pH保持在6.5.，8.5，DO浓度大于3.5mg/L(大于空气饱和的40%)。至少每周测一次水温、pH和DO;至少连续测量一个试验容器的温度.附录A中列出了
19、执行该方案的试验条件。更多关于建立流水式暴露系统和/或半静态系统的信息，见ASTME729以及常见的水生毒性试验测试。5.5 水质只要是当地可用的如泉水或经活性炭过榕的自来水)并能使非洲爪瞻蠕蚂正常生长发育的水都可以使用。不同地区的水质可能存在较大差异，尤其是当没有使用这种水来饲养爪瞻的历史数据时，需进行水质分析。特别注意水中不得含铜、氯和氯肢，这些物质对非洲爪瞻和鹏斟有毒。进一步建议分析水中氟化物、高氯酸盐和氯酸盐(饮用水消毒的副产物的背景水平，因为这些阴离子都是甲状腺腆运载蛋白的底物，任何一种阴离子水平升高都可能混淆研究结果。在试验前进行分析，正常情况下试验用水不得含这些阴离子。5.6 试
20、验用水中的确化物滚度为了让甲状腺合成甲状腺激素，鹏斟需能从水和食物中获得足够的腆化物。目前尚没有关于最低腆化物被度的经验指南。但腆化物的摄入可能会影响甲状腺系统对甲状腺活性物质的反应性，并且已知摄入碟化物可调节甲状腺的基础活性，这是解释甲状腺组织病理学结果时值得注意的一点。因此需报告试验用水中测得的腆化物浓度。根据验证研究的可用数据，已证明当试验用水的腆化物。1浓度在0.5g/L,._ 10g/L时该试验方案效果良好。理想情况下，试验用水的最低腆化物浓度为0.5g/L。如果试验用水是由去离子水配制的，需添加腆，使最低浓度达到0.5g/L。报告中应注明试验用水的腆或其他盐类添加情况.5.7 动物
21、饲养5.7. t 成体饲育成体饲育按照标准指南ASTME1439进行，更多信息可参见FETAX标准指南。这类标准指南提供了一个适当的饲育方法植例，但不要求严格遵守。为了诱导青种，给成对(3对.，5对的成年雌性和雄性蛙注射hCG.雌性和雄性样本分别约注射需解于0.6% ., 0.9 %盐水的800IU ., 1 000 IU、600 IU ., 800 IU的hCG.为了促进抱对，将育种的成对样本置于大缸中，在静态条件下，不受打扰，每个育种缸底部有一个不锈钢或塑料傲的网格，可以让卵团落到缸底。傍晚时注射的蛙通常在第二天上午时产卵最多.当足够数量的卵产出并受精后，将成体蛙从青种缸中取走，3 GB/
22、T 30664-2014 5工2自属斟饲养和选择5工2.1将成体蛙取出育种缸后，收集卵，并用所有育种缸中胚胎的一个代表性亚群来评价存活力.根据胚胎存活力以及是否有足够数量的胚胎最少1500)来保留最好的卵(建议留2个3个，以评价卵的质量研究中使用的所有试验动物都需来摞于单次产卵(即卵不得握合。将胚胎转移到大的平皿或培养皿中，见标准指南ASTME729中的定义，用移液器或药用滴管将明显死亡或异常的卵吸出。从3个卵中挑选1个健全的胚胎，转移到3个单独的膊化缸中。4天后，根据存活力和孵化成功情况选出最佳孵化卵，将孵化的蝴斟转移到适当数量的饲养缸中，温度为22(;士1(;。将另外一些蝴斟放到其他的缸中
23、，以便在第一周饲养缸中出现死亡个体时作为替补。这样可保持试验动物密度一致，从而减少单卵群内的发育分化.每天用虹吸管将所有饲养缸清理干净。操作时需注意最好戴塑料手套或丁腊手套，不要戴乳胶手套。第一周时每天及时清除死亡个体并加人替补以保持试验动物密度.每天至少喂食两次。5.7.2.2 在预暴露阶段，使蜡斟适应实际暴露阶段的条件，包括食物类型、温度、光照周期和培养基。因此，建议在预暴露阶段和暴露阶段使用相同的培养用水/稀释用水。如果在预暴露阶段使用静态培养系统饲养蜡衅，每周至少要彻底更换两次培养基，避免在预暴露阶段由于蝴斟密度高而引起拥挤现象，否则会显著影响鹏斟在后续试验阶段的发育。饲养密度不超过约
24、4只蝴斟/L培养基(静态暴露系统或10只蝴斟/L培养基如预暴露或培养系统的流速达到50mL/min) 0在此条件下，鹏斟在12天内从45/46阶段发育到51阶段。每天检查该储备种群中代表性蝴斟的发育阶段，以估计开始暴露的合适时间点。尽可能减少蝴蚂的胁迫和外伤，尤其在移动、清洗鱼缸和操作蠕斟时。避免应激条件/活动，如z较大和/或连续的噪声、敲击鱼缸、振动鱼缸、在实验室内过多活动和快速改变环境介质光照时间及强度、温度、pH值、DO、水流速等)。如果蝴斟没有在受精后17天内发育到51阶段，需考虑压力过大是否为潜在原因.5.7.3 蜡蝇的培养和暇食在预暴露阶段见NieuwkoopPD, Faber J
25、中NF45/46阶段之后和整个21天试验期间，给蝴蚂喂食适当饲料或者其他已经证明能使两栖类变态试验达到同等性能的食物。仔细调整预暴露阶段的喂食方案以满足正处于发育中酶衅的需求，即对于新膊化的蠕蚂每天少量多投至少每天两次。为r保证水质以及防止食物颗粒及碎屑堵塞跑过滤，避免投食过多。在试验开始前，将每天的食物定量随蝴斟的生长增加至大约30kg/(动物天。因此，将每天的食物总量分成几小部分，每天至少喂两次。表1列出了喂食方案。记录喂食频率。表1流水条件下AMA非洲爪蝠蝴斟生存期间喂食方案食物定量研究日mg/(动物天)。4 30 5 - 7 40 8 - 10 50 11 - 14 70 15 - 2
26、1 80 4 GB/T 30664-2014 5.8 分街化学在进行研究前利用现有的溶解性、降解性和挥发性信息，评价受试化学品的稳定性.在试验开始时第0天从每个浓度的各平行缸中取受试液样本进行分析化学分析，在试验过程中至少每周抽取4份样本进行分析。建议在试验开始前的系统准备期间对每个试验浓度进行分析以检验系统性能。另外，还建议在改变储备液时对储备液进行分析，尤其是在常规抽样期间储备攘的量不足以提供足够的化学品时。如果试验使用的几个或所有浓度的化学品不可捡出，测量储备被并记录系统流速以计算标称浓度，5.9 化学晶输送5.9.1 可以根据化学品的理化特性使用不同的方法将受试化学品引人系统。在流动系
27、统中水溶性化学品可以用几等份试验用水榕解，使其浓度达到能以目标试验浓度输送。在室温下为被态并且在水中溶解度很小的化学品可以用液体z液体饱和法引人。在室温下为固体并且在水中需解度很小的化学品可以用玻璃棉柱饱和法2】引人。最好使用无载体试验系统，但不同的受试化学品具有不同的理化特性，可能需要用不同的方法制备化学品暴露液。由于z一些溶剂本身可能具有毒性和/或引起不良或非预期的内分泌反应z受试化学品超过其水中溶解度使用溶剂时经常会发生这种情况会导致有效浓度测定不准确s在长期试验中使用溶剂会引起与微生物活性有关的显著程度的生物膜现象，故尽量避免使用溶剂或载体。对于难测性物质，将禧剂作为最后选择的手段，并
28、参见OECD难于进行测试的物质和浪合物水生毒性检测的指导文件以确定最佳方法。榕剂的选择由受试化学品的化学特性决定，巳知有效用于水生毒性试验的榕剂包括丙酣、乙障、甲薛、二甲基甲酷腊和三甘醇。5.9.2 如果使用潜剂载体，榕剂浓度需低于慢性无可见影响雄度(NOEC); OECD指导文件3)建议最大为100L/L;近期审核4)建议使用溶剂浓度低至20L/L稀释用水。如果使用了潜剂载体，除了非溶剂对照外还需设立相应的溶剂对照(洁净水进行评价。如果由于化学品的理化性质(禧解度低或化学品可获得性有限使其不可能通过水给予暴露，可以考虑通过食物引人暴露。关于食物暴露方式已进行了初步工作，但这种暴露途径并不常用
29、。记录试验方法的选择并进行分析验证。5.10 试验浓度选择5.10.1 建立高试验浓度z进行试验时，根据受试化学品的溶解度限度、急性毒性化学品的MTC或100 mg/L建立高试验被度，选择三者中的最低浓度。5.10.2 MTC的定义是化学品引起小于10%急性死亡率的最高试验雄度.用这个方法的前提是假设已有关于急性死亡率的经验数据，可以根据该数据估计MTC。估计MTC不准确，一般需要进行专业判定。虽然使用回归模型可能是技术上最合理的MTC估计方法，但是根据现有的急性数据使用急性LCso值的1/3可得到MTC的近似值，但也有可能缺乏试验物种的急性毒性数据。如果没有特定物种的急性毒性数据，可以用AM
30、A试验物种的代表性鹏蚂即相同阶段完成96h的LCso试验。或者如果能获得其他水生物种的数据如z鱼类或其他两栖类物种的LCso研究)，可以根据物种间外推法运用专业判断估计可能的MTC.5.10.3 如果该化学品不具有急性毒性并且榕解度大于100mg/L，将100mg/L作为最高试验浓度，因为该浓度一般被认为实际上无毒。5.10.4 虽然半静态式方法并非推荐试验方法，但当流水法不足以达到MTC时可以使用该方法。如果2) 参见参考文献2.3) 参见参考文献1.4) 参见参考文献3.5 GB/T 30664-2014 使用半静态式方法，记录受试化学品浓度的稳定性并保持在性能标准限度范围内。建议换水周期
31、为24 h，最长不得超过72h.另外每个换水周期结束时在换水前应测量水质参数如DO、温度、pH值等).5.10.5试验浓度范围E要求至少有三个试验浓度和一个洁净水对照必要时还有溶剂对照。最高和最低试验榷度间的最小差值约为一个数量级。剂量差最大为0.1，最小为0.33.6 试验步骤6.1 试验开始和进行6.1.1 第0天E见NieuwkoopPD , Faber J，当预暴露储备种群中有足够数量的蝴斟发育到NF51阶段时开始暴露，这段时间小于或等于受精后17天。挑选试验动物时，将储备种群中健康并且表现正常的蝴斟混合放入一个单独的容器中内含适当体积稀释用水。使用小网或舔网将蝴蚂逐个从混合缸中转移到
32、一个含稀释用水的透明箱中(如:100 mm Petri培养皿)，以确定发育阶段。在确定阶段时，最好不要麻醉，但是在操作前也可以使用经碳酸氢铀缓冲的100mg/L三卡因甲磺酸盐(如M5-222)(pH7.0)，将蜡斟逐一麻醉。如果要进行麻醉，向有经验的实验室咨询使用如M5-222进行麻醉的正确方法，并与试验结果一起报告。在转移时一定要小心操作以减小操作压力，避免动物受到损伤。6.1.2 用双目解剖显微镜确定动物的发育阶段。为了减少发育阶段的最终差异，阶段的划分需尽可能准确。按照NF的描述，选择51阶段试验动物的主要发育标志是后肢形态。在显微镜下检查后肢的形态特征。全面的蝴斟发育分期信息参见NieuwkoopPD , Faber J ，突出的形态学标志可确定发育阶段。可使用表2简化整个研究中的阶段鉴定过程并使其标准化，该表列出了正常发育情况下不同阶段相关的突出形态学标志。表2捏捏Neuwkoop和Faber指导的突出形态学阶段标志发育阶段突出的形态学标志51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 后肢
