1、GB/T 4789.28-2003 192 前言本标准对GB/T4789.28-1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂进行修订。本标准与GB/T4789.28-1994相比主要修改如下z按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式进行修改。删去4.78中的高盐察民培养基。本标准自实施之日起，GB/T4789. 28-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口.本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人2周桂莲、:XiJ宏道、罗雪云、李风琴、付萍.本标准于1984年首次发布，1994年第一次修订，本次为第二次修订.1 范围食品卫生微生物学检验
2、染色法、培养基和试剂本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2 染色液配制及染色法2. 1 美蓝染色法2. 1. 1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3 g 95%乙醇30 mL 0.01 %氮氧化何溶液100 mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化押溶液混合。2. 1. 2 染色法将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染1min-3 min，水洗，待干，镜检。2. 1. 3 结果菌体呈蓝色。2.2 革兰氏染色法2. 2. 1 结晶紫染色液结晶紫1 g 95%乙醇20 mL 1%草酸镀水溶液80 mL 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。2.2.
3、2 革兰氏破液硕硕化饵蒸t富水1 g 2 g 300 mL G/T 4789.28-2003 将腆与腆f七饵先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸铺水至300mL 2.2.3 沙黄复染液沙黄0.25 g 95%乙醇10 mL 蒸馆水90 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。2.2.4.2 滴加革兰氏硕液，作用1mn.水洗。2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30的或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色105 , 193 GB/T 4789.28-2003
4、2.2.4.4 水洗，漓加复染液.复染min。水洗，待于，镜检。2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注:亦可用1 10稀释石炭酸复红染色液作复染液，重染时间仅需10s 0 2. 3 耐酸性染色法(蔓倪二氏法)2. 3. 1 石炭酸晶红染色液碱性品红0.3 g 95%乙醇10 mL 5%盼水溶液90 mL 将品红榕解于乙醇中，然后与盼溶液混合。2.3.2 3%盐酸乙醇浓盐酸:l mL 95%乙醇97 mL 2.3.3 复染液日氏碱性美蓝染色液。2.3.4 染色法2.3.4.1 将涂片在火焰上力11热固定，漓加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发
5、减少时.应随时添加。染5IIlln，倾去染液，水洗。2.3.4.2 滴加盐1峻乙醇脱色，直至元红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1min_ :l mtn).!:洗。2.3.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液。复染30s,-._, 1 min 水洗，待干，镜检。2.3.5 纺呆:耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。2.4 柯氏染色法2. 4. 1 染色液2.4.1.10.5%沙黄液。2.4.1.20.5%孔雀绿液。2.4.2 染色法2.4.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约2min-3 min.水洗。2.4.2.2 滴加0.5%孔雀绿液，复染40
6、s50 50水洗，待干，镜检。2.4.3 结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。2.5 奥尔特氏芙膜染色法2. 5. 1 染色液沙黄3 g 蒸馆水100 mL 用乳钵研磨溶解。2.5.2 染色法将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3mino水洗，待干，镜检。2.5.3 结果炭殖芽胞杆茵茵体呈赤褐色，英膜呈黄色。2.6 瑞氏染色法2. 6. 1 染色液瑞氏色素。.1 g 194 甲醇60 mL 用乳钵研磨溶解。2.6.2 染色法2.6.2.1 涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1minc 2.6.2.2 加入等量蒸馈水CpH6.5)，染色3min,._ 5 mino 2
7、.6.2.3 用蒸馆水冲洗，待干，镜检。2. 7 鞭毛染色法2. 7. 1 染色液的配制GB/T 4789.28-2003 2.7.1.1 甲液:称单宁酸5g氯化高铁CFeCl，)1. 5臣，溶于100mL蒸馆水中，待溶解后加入1%的氢氧化饷溶液1mL和15%的甲醒溶液2mL, 2.7. 1. 2 乙液:称2g硝酸银溶于100mL蒸馆水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化镀海液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止(此为关键性操作，应特别小心)。滴加氢氧化锁和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2d3 d基本无效。2.
8、7.2 染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4rnin_ 6 min后，用蒸馆水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟(加热时注意勿使出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜枪，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2. 8 碱性复红染色法将0.5g碱性复红染料溶解于20mL 95%乙醇中，然后用蒸馆水稀释至100mL。如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。注z本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色籍以与蜡样芽胞杆菌相区别。3 生化试验培养基和试剂3. 1 Hugh-Leifson培养基CO/F试验用)3. 1. 1 成分蛋臼陈2 g 氯化饷5 g
9、 磷酸氢二何琼脂葡萄糖0.2%澳靡香草酸蓝溶液蒸馆水pH7.2 3. 1. 2 制法0.3 g 4 g 10 g 12 mL 1 000 mL 将蛋白陈和盐类加水溶解后，校正pH至7.2，加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后.分装试管，121C高压灭菌15min，直立凝固备用。3. 1. 3 试验方法从斜阳t挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表团，高度约1cm，于36C士1C培养。3. 1. 4 结果结果见表L195 GB/T 4789.28-2003 反应类型发酵型(F)氧化型(0)产碱型(A)3.2 糖发酵管3. 2. 1
10、 成分牛肉膏蛋白陈氯化饷磷酸氢二锅(Na，HPO，.12H20) 0.2%澳踌香草盼蓝溶液蒸惰水pH7.4 3.2.2 制法表1封口的培养基5 g 10 g 3 g 2 g 产酸不变不变12 mL 1 000 mL 开口的培养基产酸产酸不变3.2. 2. 1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加人葡萄糖，分装子有个倒置小管的小试管内，121C高压灭菌15min。3.2.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121C高压灭菌15mno另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注;M.糖不纯，加热后会
11、自行水解者，应采用过滤法除菌.3.2.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36C土IC培养，一般观察2d3 d.迟缓反应需观察14d30 d. 3.3 ONPG培养基3. 3. 1 成分邻硝基酷-D-半乳糖背(ONPG)(0-Ni trophenyl-D-galactopyranosideJ 0.01 mol/L磷酸锅缓冲液(pH7.5)J%蛋白陈水(pH7.5)3.3.2 制法60 mg 10 mL 30 mL 将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白豚水，以过滤法除菌，分装于10mmX75 mm试管，每管。.5mL，用橡皮塞塞紧。3.3.3 试验方法自琼脂斜面上挑取培养物-满环接种于3
12、6C土IC培养1h3 h和24h观察结果。如果自半乳糖背酶产生，则于1h3 h变黄色，如元此酶则24h不变色。3.4 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用)3. 4. 1 成分196 磷酸氢二梆多陈葡萄糖蒸馆水pH7.。5 g 7 g 5 g 1000 mL 3.4.2 制法溶化后校正pH.分装试管，每管1mL.121C高压灭菌15mino 3.4.3 甲基红CMR)试验GB/T 4789.28-2003 自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于360C士10C培养2d 5 d.哈夫尼亚菌则应在22 C 250C培养。滴加甲基红试ifiJ一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试
13、剂配法:10 mg甲基红溶于30mL 95%乙醇中，然后加入20mL蒸馆水。3. 4. 4 v-p试验用琼脂培养物接种本培养基中，于360C士rc培养2d4 do哈夫尼亚菌则应在220C250C培养。加入6%荼盼乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化御溶液0.2mL.充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36C士10C培养4h再进行观察。3.5 西藏氏拧楝酸盐培养基3. 5. 1 成分氯化纳硫酸续CMgS，. 7Hz ) 磷酸二氢镣磷酸氢二饵拧橡酸铀琼脂蒸馆水0.2%澳庸香草盼蓝溶液pH6.8 3.5.2 哥哥法5 g 0.2 g 1 g 1 g 5 g 20 g
14、 1000 mL 40 mL 先将盐类熔解于水内，校正pH.再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，1210C高压灭菌15min。放成斜面。3.5.3 试验方法挑取少量琼脂培养物接种，于360C土10C培养4d.每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。3.6 克氏拧楝酸盐培养基3. 6. 1 成分拧橡酸纳3 g 葡萄糖0.2 g 酵母浸膏0.5 g 单盐酸半脱氨酸。1g 磷酸二氢何1 g 氯化纳5 g 0.2%盼红溶液6 mL 琼脂15 g 蒸馆水1000 mL 3.6.2 制法加热溶解，分装试管.1210C高压灭菌15min，放成斜面。3.6.3 试验方法
15、用琼脂培养物接种整个斜面，在360C土10C培养7d，每天观察结果。阳性者培养基变为红色。197 GB/T 4789.28-2003 3. 7 丙二酸铀培养基3. 7. 1 成分酵母浸膏硫酸钱磷酸氢二御磷酸二氢惆氯化销丙二酸锅。2%漠靡香草酣蓝溶液蒸馆水pH6.8 3.7.2 制法1 g 2 g 0.6 g 0.4 g 2 g 3 g 12 mL 1 000 mL 先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，1210C高压灭菌15min。3. 7. 3 试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于360C士10C培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.8 葡葡糖镀培养基3. 8
16、. 1 成分氯化纳硫酸筷CMgSO.7H20) 磷酸二氢饺磷酸氢二惆葡萄糖琼脂蒸馆水0.2%漠蔚香草盼蓝溶液pH6.8 3.8.2 制法5 g 0.2 g 1 g 1 g 2 g 20 g 1000 mL 40 mL 先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热熔化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，1210C高压灭菌15mint放成斜面。3.8.3 试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36(;士IOC培养24人阳性者葡萄糖镀斜面上有
17、正常大小的菌落生长;阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖镀斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。注容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馆水冲洗干净.并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。3. 9 马尿酸纳培养基3. 9. 1 成分马尿酸锅1 g 肉浸液100 mL 3.9.2 制法将马尿酸纳溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高度，高压灭菌121oC20 mino 198 GB/T 4789.28-2003 3.9.3 试剂兰氯化铁(FeC13 6HzO)12 g.溶于2%盐酸溶液100mL中即成。3.
18、9.4 试验方法用纯培养物接种，于42C培养48h.观察培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时，用蒸馆水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清液0.8mL，加人三氯化铁试剂。.2mL，立即混合均匀，经10min 15 mn，观察结果。3.9.5 结果出现恒久沉淀物为阳性。3. 10 曹养明胶3. 10. 1 成分蛋白陈牛肉膏明胶蒸馆水5 g 3 g 120 g 1 000 mL pH6. 87. 0 3. 10. 2 制法加热溶解、校正至pH7.47. 6.分装小管.121C高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.87.0.3. 10. 3 试验方法用琼脂培养物穿刺接种，放
19、在22C25C培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在36C土IC培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。3. 11 苯丙氨酸培养基3. 11. 1 成分酵母浸膏DI苯丙氨酸(或L苯丙氨酸1g) 磷酸氢二饷氯化纳琼脂蒸馆水bgbgb 321i 5 g 12 g 1000 mL 3. 11. 2 制法加热溶解后分装试管.121C高压灭菌15min，便成斜面。3. 11. 3 试验方法自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯丙氨酸琼脂，在36C土IC培养4h或18h24 h。滴加10%三氯化铁溶液2滴3滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。3. 12 氨基酸脱竣酶试验培养基3.
20、 12. 1 成分蛋白陈酵母浸膏葡萄糖蒸馆水1.6%澳甲盼紫-乙醇溶液L-氨基酸或OL-氨基酸pH6.8 gbghugb 531 1 000 mL 1 mL 0.5或1g/IOO mL 199 GB/T 4789.28-2003 3. 12.2 制法除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸z赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L氨基酸按0.5%加入，DL氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL.上面滴加-层液体石蜡.115C高压灭菌10mino 3. 12. 3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36C土1C培养18
21、h24 h.观察结果。氨基酸脱竣酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者元碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。3. 13 蛋白陈水(障基质试验用)3. 13. 1 成分蛋白陈或膜蛋白陈)氯化纳蒸储水pH7.4 3. 13. 2 司司法20 g 5 g 1000 mL 按上述成分配制，分装小试管.121C高压灭菌15mio, 3. 13. 3 霞基质试剂3. 13. 3. 1 柯凡克试剂.将5g对二甲氨基甲醒溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。3.13.3.2 欧波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醒熔解于95mL95%乙醇内，然后缓慢加入浓盐酸20mL, 3. 1
22、3. 4 试验方法挑取小量培养物接种，在36C士1C培养1d2 d.必要时可培养4d5 d.加入柯儿克试剂约0.5 mL.轻摇民管，阳性者于试剂层呈深红色g或加入欧波试剂约0.5mL.沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注g蛋白陈中应吉再丰富的色氨酸。每批蛋白陈买来后，应先用己知菌种鉴定后方可使用。3. 14 硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用)3. 14. 1 成分牛肉膏3 g 酵母浸膏3 g 蛋白陈10 g 硫酸亚铁0.2日硫代硫酸纳0.3 g 氯化纳5 g 琼脂12日蒸馆水1000 mL pH7.4 3. 14.2 制法加热溶解，校正pH.分装试管.115C高压灭菌15m
23、in，取出直立候其凝固。3. 14. 3 试验方法挑取琼脂培养物，沿管壁穿刺，于36C土IC培养1d2 d，观察结果。产硫化氢者使培养基变为黑色。注g肠抨菌科细菌测定硫化氢的产生，应采用三糖铁琼脂或本培养基。3. 15 尿素琼n3. 15. 1 成分蛋白豚200 1 g 氯化纳葡萄糖磷酸二氢御0.4%盼红溶液琼脂蒸馆水20%尿素溶液pH7.2士o.1 3. 15.2 制法GBjT 4789.28-2003 5 g 1 g 2g 3 mL 20 g 1000 mL 100 mL 将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH.加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121c高压灭菌15 min。冷至50.C55
24、.C.加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%.最终pH应为7.2土。1.分装于灭菌试管内，放成斜面备用。3. 15.3 试验方法挑取琼脂培养物接种，在36.C士I.C培养24h.观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。3. 16 氧化饵(KCN)培养基3. 16. 1 成分蛋白陈氯化纳磷酸二氧梆磷酸氢二锅蒸馆水0.5%氟化饵溶液pH7.6 3. 16.2 制法10 g 5 g O. 225 g 5.64 g 1000 mL 20 mL 将除氟化饵以外的成分配好后分装烧瓶.121.C高压灭菌15mino放在冰箱内使其充分冷却。每100 mL培养基加入0.5%氟化御溶液2.0mL
25、(最后浓度为l10000).分装于12mmXI00 mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4.C冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加佩化仰的培养基作为对照培养基，分装试管备用。3. 16.3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白陈水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氟化梆(KCN)培养基。并另挑取I环接种于对照培养基。在36c士1C培养1d2 d.观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制).经2 d细菌不生长为阴性(抑制)。注2氟化饵是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氧化御逐渐分解，产生氧氟酸气体逸出，以致药物浓度降
26、低，细菌生长.因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。3. 17 硝隘盐培养基3. 17. 1 成分硝酸饵0.2 g 蛋白陈5 g 蒸馆水1000 mL pH7.4 3. 17. 2 哥哥法溶解，校正pH.分装试管，每管约5mL. 121 c高压灭菌15mino 201 C/T 4789.28-2003 3. 17.3 硝酸盐还原试剂3.17.3.1 甲液=将对氨基苯磺酸0.8g海解于2.5mol!L乙酸溶液100mL中。3.17.3.2 乙液将甲茶胶0.5g溶解于2.5 rnol/L，乙酸溶液100mL中。3. 17.4 试验方法接种后在36C士IC培养1d4 d.加入甲液和乙液各
27、一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色。注，本试验阴性的原因有三细菌不能还原硝酸盐;亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入铮粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。3. 18 氧化酶试验3. 18. 1 试剂3.18.1.1 1%盐酸二甲基对苯二胶溶液2少量新鲜自己制，于冰箱内避光保存。3.18. 1. 2 l%a-茶盼乙醇溶液。3. 18. 2 试验方法3.18.2.1 取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胶溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深，再加荼酣溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分
28、钟内不变色。3.18.2.2 以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。3. 19 细胞色素氧化酶试验3. 19. 1 试剂3.19.1.11%盐酸二甲基对苯二胶溶液。3.19.1.2 1%荼盼乙蹲溶液。3. 19. 2 试验方法取37C(或低于37C)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各2滴3滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。3. 19. 3 结果于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。3.20 过氧化氢酶试验3.
29、 20. 1 试剂3%过氧化氢溶液，I陆用时配制。3.20.2 试验方法挑取固体培养基上菌落一接种环.置于洁净试管内，满加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。3.20.3 结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。3.21 过氧化物酶试验3. 2 1. 1 试剂3.21.1. 1 2%儿茶盼滚液。3.21. 1.2 3%过氧化氢溶液。3. 2 1. 2 试验方法挑取团体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加2%儿茶盼溶液1rnL及3%过氧化氢溶液1mL。静置于室温(20C)中30mn60 min，观察结果。3. 21. 3 结果阳性反应，细菌变为黑褐色;阴性反应，细菌不变色。202
30、 注，过氧化物酶的作用可受氟化御的抑制。3.22 磷酸盐缓冲液3.22. 1 储存液磷酸工氢饵1 mol/L氢氧化纳溶液蒸馆水pH7.2 3.22.2 制法34 g 175 mL 825 mL GB/T 4789.28-2003 先将磷酸盐溶解于500mL蒸馆水中，用1mol/L氢氧化纳溶液校正pH后，再用蒸馆水稀释至1000 mL。3.22.3 稀释液取储存液1.25 mL，用蒸馆水稀释至1000 mL，分装每瓶100mL或每管10mL，121C高压灭菌15 rnino 3.23 明胶磷酸盐缓冲液3.23. 1 成分明胶磷酸氢二锅蒸倒水pH6.2 3.23.2 制法2 g 4 g 1000
31、mL 加热溶解，校正pH，121C高压灭菌15min, 3.24 乳酸苯酣溶液3. 24. 1 成分苯盼10 g 乳酸(密度1.21kg/m3) 10 g 甘油20 g 蒸馆水10 mL 3.24.2 制法将苯盼在水中加热溶解，然后加入乳酸及甘泊。3.24.3 用途检验真菌形态时用。4 一般培养基和专用培养基4. 1 肉漫液肉汤4. 1. 1 成分绞碎牛肉氯化销蛋白陈磷酸氢二佣蒸馆水4. 1. 2 制法500 g 5 g 10 g 2 g 1000 mL 将绞碎之去筋膜元油脂牛肉500g加蒸馆水1000mL，混合后放冰箱过夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤
32、压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白陈、氯203 GB/T 4789.28-2003 化销和磷酸盐，溶解后校正pH7.47. 6煮沸并过滤，分装烧瓶.121C高压灭菌30min, 4.2 肉漫液琼脂4. 2. 1 成分肉浸液肉汤(pH7.4)琼脂4.2.2 制法1000 mL 17 g20 g 加热溶化琼脂，分装烧瓶或试管.121c高压灭菌30min。根据需要，倾注平板或放成斜面。4.3 牛肉(或牛心消化汤4. 3. 1 成分绞碎牛肉(或牛心)15%氢氧化纳溶液膜蛋白酶三氯甲烧氯化锅蒸馆水4.3.2 制法1 000 g 27 mL 40 mL 1 mL 10 g 2000 mL 4.3.2.
33、1 称取碎牛肉，加蒸馆水，隔水加热到80C.维持15mno 4.3.2.2 如氢氧化锅溶液，对pH试纸呈弱碱性，冷至40C。4.3.2.3 加族蛋白酶、三氯甲烧，在36C土1C放置4h5 h.每小时摇动-至二次。4. 3. 2. 4 4 h后，吸取上层液5mL于试管中，加5%硫酸铜溶液0.1mL、4%氢氧化纳溶液5mL.混合之。若呈红色，则不须再消化，可由温箱取出。4.3.2. 5 加入15%乙酸溶液45mL.对pH试纸呈酸性。4.3.2.6 煮沸15min，使膜蛋白酶破坏，冷后，放冰箱内一夜。4.3.2.7 次日吸取上层清液，加氯化销10g.并加水补足原量，煮沸。4.3.2.8 校正pH7.
34、47. 6(加15%氢氧化纳溶液约10mL).加热。用滤纸过滤，分装烧瓶.121C高压灭菌20min。注1，此培养基可作为琼脂培养基的基础，不需加蛋白陈曰注2，膜蛋白酶之配和y，称取去脂绞碎的猪膜500g.b口人乙醇500mL、蒸馆水1500mL.混合之，装人玻塞瓶内。每日摇匀三次。3d后，用绒布过滤挤出其汁.加盐酸至0.05%，放冰箱内保存备用。4.4 血消化汤4. 4. 1 成分绞碎猪胃绞碎猪血块蒸馆水浓盐酸4.4.2 ffitJ法100 g 100 g 1000 mL 10 mL 4.4.2.1 洗涤猪胃，除去油脂，保留胃粘膜，用绞肉机绞碎。4.4.2.2 用绞肉机将猪血块绞碎。4.4.
35、2.3 将蒸馆水加热至55C.加入猪胃、猪血块和盐酸，宣55C水浴中24h.时常加以摇动。4.4.2.4 从水浴内取出，加入1moL/L碳酸销溶液5mL，煮沸10mn，置于冰箱内一夜。4.4.2.5 吸取上层清液，加磷酸氢二御1g.:b日热至75C.加入1mo/L碳酸销溶液45mL.煮沸，校正pH7. 27. 4。204 GB!T 4789.28-2003 4.4.2.6 用滤纸过滤，分装烧瓶.121C高压菌20min. 注1，丰培养基不吉糖可供作鉴别培养基之基础，不需加蛋白陈和氯化俐。注2，1 mo1/L碳酸锅溶液之配法元水碳酸锅10.6g.溶于1000 mL蒸馆水中。4.5 豆粉琼脂4.
36、5. 1 成分牛心消化汤(pH7.4-7.的琼脂黄豆粉浸液4.5.2 制法1 000 mL 20 g 50 mL 将琼脂加在牛心消化汤内，加热溶解，过滤加入豌豆粉浸液，分装每瓶100mL 121C高压灭菌15mino 豌豆粉浸液制法取豌豆粉5g、氯化销10g.加入蒸馆水100mL置100C水浴内加热1h.放于冰箱中过夜。吸取上清液即为豌豆浸液。4.6 血琼脂4. 6. 1 成分豆粉琼脂(pH7.4-7. 6) 脱纤维羊血(或兔血)4.6.2 制法100 mL 5 mL-I0 mL 加热溶化琼脂，冷jlJ50C，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可分装灭茵试管，置成斜面。亦可用其他营养
37、丰富的基础培养基配制血琼脂。4. 7 营养琼脂4. 7. 1 成分蛋白陈牛肉膏氯化纳琼脂蒸馆水4.7.2 制法10 g 3 g 5 g 15 g-20 g 1 000 mL 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馆水内，加人15%氮氧化纳溶液约2mL校正pH至7.2-7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121C高压灭菌15mino 注此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面。如用于菌落计数，琼脂量为1.5%，O作成平板或斜面.则应为2%。4.8 营养肉汤4. 8. 1 成分蛋白豚牛肉膏氯化例蒸馆水pH7.4 4.8.2 哥哥法10 g 3 g 5 g 1 000 mL 按上述成分
38、混合，溶解后校正pH，分装烧瓶，每瓶225mL, 121 c高压灭菌15min 0 4.9 乳糖胆盐发酵笛4. 9. 1 成分蛋白陈20 g 205 GB/T 4789.28-2003 猪胆盐(或牛、羊胆盐乳糖0.04%澳甲盼紫水溶液蒸馆水pH7.4 4.9.2 制法5 g 10 g 25 rnL 1 000 rnL 将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH.加入指示剂，分装每管10rnL，并放入一个小倒管，115C高压灭菌15min。注2双料乳糖胆盐发酵管除蒸馆水外，其他成分加倍。4. 10 乳糖发酵管4. 10. 1 成分蛋白陈乳糖0.04%澳甲盼紫水溶液蒸馆水pH7.4 4. 10. 2
39、制法20 g 10 g 25 rnL 1 000 rnL 将蛋白陈及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30rnL、10rnL或3mL，并放入一个小倒管，115.C高压灭菌15rnin。注1双料乳糖发酵管除蒸锢水外，其他成分加倍。注2:30 mL和10时，乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。4. 11 EC肉汤4. 11. 1 成分膜蛋白陈20日3号胆盐(或混合胆盐)乳糖磷酸氢二饵磷酸二氢何氯化制蒸馆水4. 11. 2 制法1. 5g 5 g 4 g 1. 5g 5 g 1 000 rnL 将上述成分混合，溶解后，分装有发酵倒管的试管中，121.
40、C高压灭菌15min ，最终pH为6.9士0.2。4. 12 缓冲蛋白膝水(BP)4. 12. 1 成分蛋白陈氯化销10 g 5 g 磷酸氢二纳(Na2HPO，.12H20)9g 磷酸二氢饵1. 5g 蒸馆水1 000 rnL pH7.2 4. 12.2 制法按上述成分配好后以大烧瓶装，121.C高压灭菌15rnin。临用时元菌分装每瓶225rnL。注，本培养基供沙门氏菌前增菌用。206 4. 13 氯化镶孔雀绿增菌渡(MM)4. 13. 1 甲液膜蛋白陈氯化销磷酸二氢饵蒸馆水4.13.2 z:液氮化筷(化学纯)蒸筒水4. 13. 3 丙液。.4%孔雀绿水溶液。4. 13. 4 制法5 g 8
41、 g 1. 6 g 1 000 mL 40日100 mL G/T 4789.28-2003 分别按上述成分配好后，121C高压灭菌15min备用。临用时取甲液90mL、乙液9mL、丙液0.9 mL.以无菌操作混合即可。注本培养基亦称Rappaport10(Ro)增菌液。4. 14 四硫磺酸纳煌绿增菌液(TT)4. 14. 1 基础培养基多陈或胀胆盐碳酸钙硫代硫酸铀蒸馆水4. 14.2 穰溶液腆腆化何蒸馆水4. 14. 3 制法5 g 1 g 10 g 30 g 1 000 mL 6 g 5 g 20 mL 将基础培养基的各成分加入蒸馆水中，加热溶解，分装每瓶100mL分装时应随时振摇，使其中的
42、碳酸钙混匀。121C高压灭菌15min备用。临用时每100mL基础培养基中加入腆溶液2mL，0.1%煌绿由于液1mL4. 15 囚硫横酸铀煌绿增菌液(换用方法4. 15. 1 基础液蛋白脐、10 g 牛肉膏5 g 氯化纳3 g 碳酸钙45 g 蒸馆水1000 mL 将各成分加人于蒸馆水中，加热至约70C溶解，校正pH至7.。土0.1，121(:高压灭菌20min。4. 15. 2 硫代硫酸锅溶液硫代硫酸纳(NaZSZ03.5H20) 50 g 蒸馆水加至100ll1L 4. 15. 3 破溶液腆片20 g 207 GB/T 4789.28-2003 破化柳25 g 蒸饱水加至100mL 将殃化
43、御充分溶解于最少量的蒸馆水中，加人腆片，振摇玻瓶至殃片全部溶解，再加人蒸馆水至规定量，贮于棕色玻瓶内，紧塞瓶盖备用。4. 15.4 煌绿水溶液煌绿蒸馈水0.5 g 100 mL 存放暗处，不少于1d.使其自然灭菌。4. 15.5 牛胆盐溶液干燥的牛胆盐10 g 蒸绵水100 mL 煮沸溶解.121.C商压灭菌20min 4. 15. 6 制备基础液900 mL 硫代硫酸纳溶液100 mL 腆液20 mL 煌绿溶液2时，牛胆盐溶液50 mL 临用前，按上列顺序，以元菌操作依次加入于基础液中，每加入-种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。分装于灭菌瓶中，每瓶100mL. 4. 16 亚砸酸盐脱氨酸增
44、菌液倍。4. 16. 1 成分蛋白陈乳糖亚晒酸氢锵磷酸氢二锅磷酸二氢饵5 g 4g 4 g 5.5 g 4.5 g L-脱氨酸。.01g 蒸馆水1000 mL 4.16.2 1%L-就氨酸-氢氧化纳溶液的配法称取L胧氨酸。.1 g(或DL胧氨酸。.2g).加1mol/L氢氧化销1.5mL.使溶解，再加入蒸馆水8.5 mL即成。4. 16.3 制法将除亚晒酸氢销和L-脱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸馆水中，加热煮沸，俊冷备用。另将亚硝酸氢销溶解于100mL蒸馆水中，加热煮沸，俊冷，以无菌操作与上液混合。再加入l%L-脱氨酸氮氧化纳溶液1mL.分装于灭菌瓶中，每瓶100mL.pH应为7.0土。
45、.1. 4.17 GN增菌班4. 17. 1 成分膜蛋白陈20 g 葡萄糖1 g 甘露醇2 g 拧橡酸销5 g 去氧胆酸铀0.5 g 208 GB/T 4789.28-2003 磷酸氢二伺磷酸二氧惆氯化纳蒸馆水pH7.0 4.17.2 制法4 g 1. 5 g 5 g 1000 mL 按上述成分配好，加热使溶解，校正pH，分装每瓶225mL，115C高压灭菌15mino 4. 18 肠道菌增菌肉汤4. 18. 1 成分蛋白豚10 g 葡萄糖5 g 牛胆盐20 g 磷酸氢二锅8 g 磷酸二氧惆2 g 煌绿0.015 g 蒸馆水1000 mL pH7.2 4. 18.2 制法按上述成分配好，加热使
46、溶解，校正pH。分装每瓶30mL，115C高压灭菌15min, 4. 19 亚硫酸铿琼脂(B5)4. 19. 1 成分蛋白豚10 g 牛肉膏5日葡萄糖5 g 硫酸亚铁0.3 g 磷酸氢二锅4 g 煌绿0.025 g 拧橡酸储镀2 g 亚硫酸纳6 g 琼脂18 g20 g 蒸馆水1000 mL pH7.5 4. 19. 2 制法4.19.2.1 将前面五种成分溶解于300mL蒸馆水中。4. 19. 2. 2 将拧橡酸锡镀和亚硫酸锅另用50mL蒸馆水溶解。4.19.2.3 将琼脂于600mL蒸馆水中煮沸溶解，冷至80C, 4.19.2.4 将以上三液合并，补充蒸馆水至1000mL，校正pH，加0.
47、5%煌绿水溶液5mL，摇匀。冷至50C 55C ，倾注平皿。注:此培养基不需高压灭菌.制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性.应在临用前天制备，贮存于室温暗处.超过48h不宜使用。4.20 DHL琼脂(DeoxycholateHydrogen sulfide Lactose Agar) 4.20. 1 成分蛋白陈20 g 209 GBjT 4789.28-2003 牛肉膏3 g 乳糖10 g jW，糖10 g 去氧胆酸纳1 g 硫代硫酸饷2.3 g 拧橡酸销1 g 拧橡酸铁镀1 g 中性红0.03 g 琼脂18 g20 g 蒸馆水1 000 mL pH7.3 4.20.2 哥哥法将除中性红和琼
48、脂以外的成分溶解于400mL蒸馆水中，校正pH.再将琼脂于600mL蒸馆水中煮沸溶解.两液合并，并加入0.5%中性红水溶液6mL，待冷至500C55oC.倾注平板。4.21 HE琼脂CHekloenEnleric Agarl 4.21. 1 成分豚12g 牛肉膏3 g 乳糖12 g 煎糖12 g /K杨素2 g 胆盐20 g 氯化纳5 g 琼脂18日20g 蒸馆水1 000 mL 0.4%澳蔚香草盼蓝溶液16 mL Andrade指示剂20 mL 甲液20 mL 乙液20 mL pH7.5 4. 2 1. 2 制法将前面七种成分溶解于400mL蒸馆水内作为基础液$将琼脂加入于600mL蒸馆水内
49、，加热溶解。加入甲液和乙液于基础液内，校正pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至500C550C.倾注平板。注1，此培养基不可高压灭菌。注22甲液的配制硫代硫酸纳拧橡酸铁锁蒸馆水注3，乙液的配制去氧胆酸铀蒸南水注4，Andrade指示剂酸性复红210 34 g 4 g 100 mL 10 g 100 mL 0.5 g GB/T 4789.28-2003 1 mol/L氮氧化铀榕液16 mL 蒸馆水100 mL 将复红溶解于蒸馆水中，加入氢氧化销溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化纳溶液1mL2 mLo 4.22 SS琼脂4. 22. 1 基础培养基牛肉膏陈三号胆盐琼脂蒸馆水5 g 5 g 3.5日17 g 1 000 mL 将牛肉膏、陈和胆盐溶解于400mL蒸馆水
