GB T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂.pdf
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1、GB/T 4789.28-2003 192 前言本标准对GB/T4789.28-1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂进行修订。本标准与GB/T4789.28-1994相比主要修改如下z按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式进行修改。删去4.78中的高盐察民培养基。本标准自实施之日起,GB/T4789. 28-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口.本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人2周桂莲、:XiJ宏道、罗雪云、李风琴、付萍.本标准于1984年首次发布,1994年第一次修订,本次为第二次修订.1 范围食品卫生微生物学检验
2、染色法、培养基和试剂本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2 染色液配制及染色法2. 1 美蓝染色法2. 1. 1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3 g 95%乙醇30 mL 0.01 %氮氧化何溶液100 mL 将美蓝溶解于乙醇中,然后与氢氧化押溶液混合。2. 1. 2 染色法将涂片在火焰上固定,待冷。滴加染液,染1min-3 min,水洗,待干,镜检。2. 1. 3 结果菌体呈蓝色。2.2 革兰氏染色法2. 2. 1 结晶紫染色液结晶紫1 g 95%乙醇20 mL 1%草酸镀水溶液80 mL 将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸镀溶液混合。2.2.
3、2 革兰氏破液硕硕化饵蒸t富水1 g 2 g 300 mL G/T 4789.28-2003 将腆与腆f七饵先进行混合,加入蒸馆水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸铺水至300mL 2.2.3 沙黄复染液沙黄0.25 g 95%乙醇10 mL 蒸馆水90 mL 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馆水稀释。2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。2.2.4.2 滴加革兰氏硕液,作用1mn.水洗。2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色,约30的或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色105 , 193 GB/T 4789.28-2003
4、2.2.4.4 水洗,漓加复染液.复染min。水洗,待于,镜检。2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注:亦可用1 10稀释石炭酸复红染色液作复染液,重染时间仅需10s 0 2. 3 耐酸性染色法(蔓倪二氏法)2. 3. 1 石炭酸晶红染色液碱性品红0.3 g 95%乙醇10 mL 5%盼水溶液90 mL 将品红榕解于乙醇中,然后与盼溶液混合。2.3.2 3%盐酸乙醇浓盐酸:l mL 95%乙醇97 mL 2.3.3 复染液日氏碱性美蓝染色液。2.3.4 染色法2.3.4.1 将涂片在火焰上力11热固定,漓加石炭酸品红染色液,徐徐加热至有蒸气出现,但切不可使沸腾。染液如因蒸发
5、减少时.应随时添加。染5IIlln,倾去染液,水洗。2.3.4.2 滴加盐1峻乙醇脱色,直至元红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定,一般为1min_ :l mtn).!:洗。2.3.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液。复染30s,-._, 1 min 水洗,待干,镜检。2.3.5 纺呆:耐酸性细菌呈红色,其他细菌、细胞等物质呈蓝色。2.4 柯氏染色法2. 4. 1 染色液2.4.1.10.5%沙黄液。2.4.1.20.5%孔雀绿液。2.4.2 染色法2.4.2.1 将涂片在火焰上固定,滴加0.5%沙黄液,并加热至出现气泡,约2min-3 min.水洗。2.4.2.2 滴加0.5%孔雀绿液,复染40
6、s50 50水洗,待干,镜检。2.4.3 结果布氏杆菌呈红色,其他细菌及细胞呈绿色。2.5 奥尔特氏芙膜染色法2. 5. 1 染色液沙黄3 g 蒸馆水100 mL 用乳钵研磨溶解。2.5.2 染色法将涂片在火焰上固定,滴加染色液,并加热至产生蒸气后,继续染3mino水洗,待干,镜检。2.5.3 结果炭殖芽胞杆茵茵体呈赤褐色,英膜呈黄色。2.6 瑞氏染色法2. 6. 1 染色液瑞氏色素。.1 g 194 甲醇60 mL 用乳钵研磨溶解。2.6.2 染色法2.6.2.1 涂片待自然干燥后,滴加染色液,固定1minc 2.6.2.2 加入等量蒸馈水CpH6.5),染色3min,._ 5 mino 2
7、.6.2.3 用蒸馆水冲洗,待干,镜检。2. 7 鞭毛染色法2. 7. 1 染色液的配制GB/T 4789.28-2003 2.7.1.1 甲液:称单宁酸5g氯化高铁CFeCl,)1. 5臣,溶于100mL蒸馆水中,待溶解后加入1%的氢氧化饷溶液1mL和15%的甲醒溶液2mL, 2.7. 1. 2 乙液:称2g硝酸银溶于100mL蒸馆水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化镀海液,到出现沉淀后,再滴加使其变为澄清,然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中,至出现轻微雾状为止(此为关键性操作,应特别小心)。滴加氢氧化锁和用剩余乙液回滴时,要边滴边充分摇荡,染液当天配,当天使用,2d3 d基本无效。2.
8、7.2 染色法在风干的载玻片上滴加甲液,4rnin_ 6 min后,用蒸馆水轻轻冲净。再加乙液,缓缓加热至冒汽,维持约半分钟(加热时注意勿使出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色,停止加热,用水冲净,干后镜枪,菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2. 8 碱性复红染色法将0.5g碱性复红染料溶解于20mL 95%乙醇中,然后用蒸馆水稀释至100mL。如有不溶物时,可用滤纸过滤,或静置后取上清液备用。注z本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色籍以与蜡样芽胞杆菌相区别。3 生化试验培养基和试剂3. 1 Hugh-Leifson培养基CO/F试验用)3. 1. 1 成分蛋臼陈2 g 氯化饷5 g
9、 磷酸氢二何琼脂葡萄糖0.2%澳靡香草酸蓝溶液蒸馆水pH7.2 3. 1. 2 制法0.3 g 4 g 10 g 12 mL 1 000 mL 将蛋白陈和盐类加水溶解后,校正pH至7.2,加入葡萄糖、琼脂煮沸,溶化琼脂,然后加入指示剂。混匀后.分装试管,121C高压灭菌15min,直立凝固备用。3. 1. 3 试验方法从斜阳t挑取小量培养物作穿刺接种,同时接种两支培养基,其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表团,高度约1cm,于36C士1C培养。3. 1. 4 结果结果见表L195 GB/T 4789.28-2003 反应类型发酵型(F)氧化型(0)产碱型(A)3.2 糖发酵管3. 2. 1
10、 成分牛肉膏蛋白陈氯化饷磷酸氢二锅(Na,HPO,.12H20) 0.2%澳踌香草盼蓝溶液蒸惰水pH7.4 3.2.2 制法表1封口的培养基5 g 10 g 3 g 2 g 产酸不变不变12 mL 1 000 mL 开口的培养基产酸产酸不变3.2. 2. 1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5%加人葡萄糖,分装子有个倒置小管的小试管内,121C高压灭菌15min。3.2.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,121C高压灭菌15mno另将各种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。注;M.糖不纯,加热后会
11、自行水解者,应采用过滤法除菌.3.2.3 试验方法:从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36C土IC培养,一般观察2d3 d.迟缓反应需观察14d30 d. 3.3 ONPG培养基3. 3. 1 成分邻硝基酷-D-半乳糖背(ONPG)(0-Ni trophenyl-D-galactopyranosideJ 0.01 mol/L磷酸锅缓冲液(pH7.5)J%蛋白陈水(pH7.5)3.3.2 制法60 mg 10 mL 30 mL 将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白豚水,以过滤法除菌,分装于10mmX75 mm试管,每管。.5mL,用橡皮塞塞紧。3.3.3 试验方法自琼脂斜面上挑取培养物-满环接种于3
12、6C土IC培养1h3 h和24h观察结果。如果自半乳糖背酶产生,则于1h3 h变黄色,如元此酶则24h不变色。3.4 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用)3. 4. 1 成分196 磷酸氢二梆多陈葡萄糖蒸馆水pH7.。5 g 7 g 5 g 1000 mL 3.4.2 制法溶化后校正pH.分装试管,每管1mL.121C高压灭菌15mino 3.4.3 甲基红CMR)试验GB/T 4789.28-2003 自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中,于360C士10C培养2d 5 d.哈夫尼亚菌则应在22 C 250C培养。滴加甲基红试ifiJ一滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。甲基红试
13、剂配法:10 mg甲基红溶于30mL 95%乙醇中,然后加入20mL蒸馆水。3. 4. 4 v-p试验用琼脂培养物接种本培养基中,于360C士rc培养2d4 do哈夫尼亚菌则应在220C250C培养。加入6%荼盼乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化御溶液0.2mL.充分振摇试管,观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36C士10C培养4h再进行观察。3.5 西藏氏拧楝酸盐培养基3. 5. 1 成分氯化纳硫酸续CMgS,. 7Hz ) 磷酸二氢镣磷酸氢二饵拧橡酸铀琼脂蒸馆水0.2%澳庸香草盼蓝溶液pH6.8 3.5.2 哥哥法5 g 0.2 g 1 g 1 g 5 g 20 g
14、 1000 mL 40 mL 先将盐类熔解于水内,校正pH.再加琼脂,加热溶化。然后加入指示剂,混合均匀后分装试管,1210C高压灭菌15min。放成斜面。3.5.3 试验方法挑取少量琼脂培养物接种,于360C土10C培养4d.每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长,培养基从绿色转为蓝色。3.6 克氏拧楝酸盐培养基3. 6. 1 成分拧橡酸纳3 g 葡萄糖0.2 g 酵母浸膏0.5 g 单盐酸半脱氨酸。1g 磷酸二氢何1 g 氯化纳5 g 0.2%盼红溶液6 mL 琼脂15 g 蒸馆水1000 mL 3.6.2 制法加热溶解,分装试管.1210C高压灭菌15min,放成斜面。3.6.3 试验方法
15、用琼脂培养物接种整个斜面,在360C土10C培养7d,每天观察结果。阳性者培养基变为红色。197 GB/T 4789.28-2003 3. 7 丙二酸铀培养基3. 7. 1 成分酵母浸膏硫酸钱磷酸氢二御磷酸二氢惆氯化销丙二酸锅。2%漠靡香草酣蓝溶液蒸馆水pH6.8 3.7.2 制法1 g 2 g 0.6 g 0.4 g 2 g 3 g 12 mL 1 000 mL 先将酵母浸膏和盐类溶解于水,校正pH后再加入指示剂,分装试管,1210C高压灭菌15min。3. 7. 3 试验方法用新鲜的琼脂培养物接种,于360C士10C培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.8 葡葡糖镀培养基3. 8
16、. 1 成分氯化纳硫酸筷CMgSO.7H20) 磷酸二氢饺磷酸氢二惆葡萄糖琼脂蒸馆水0.2%漠蔚香草盼蓝溶液pH6.8 3.8.2 制法5 g 0.2 g 1 g 1 g 2 g 20 g 1000 mL 40 mL 先将盐类和糖溶解于水内,校正pH,再加琼脂,加热熔化,然后加入指示剂,混合均匀后分装试管,1210C高压灭菌15mint放成斜面。3.8.3 试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面,在盐水管内做成极稀的悬液,肉眼观察不见混浊,以每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种,同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36(;士IOC培养24人阳性者葡萄糖镀斜面上有
17、正常大小的菌落生长;阴性者不生长,但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖镀斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。注容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馆水冲洗干净.并用新棉花做成棉塞,干热灭菌后使用。如果操作时不注意,有杂质污染时,易造成假阳性的结果。3. 9 马尿酸纳培养基3. 9. 1 成分马尿酸锅1 g 肉浸液100 mL 3.9.2 制法将马尿酸纳溶解于肉浸液内,分装于小试管内,并于管壁画一横线。以标志管内液面高度,高压灭菌121oC20 mino 198 GB/T 4789.28-2003 3.9.3 试剂兰氯化铁(FeC13 6HzO)12 g.溶于2%盐酸溶液100mL中即成。3.
18、9.4 试验方法用纯培养物接种,于42C培养48h.观察培养液是否到达试管壁上记号处,如不足时,用蒸馆水补足至原量。经离心沉淀,吸取上清液0.8mL,加人三氯化铁试剂。.2mL,立即混合均匀,经10min 15 mn,观察结果。3.9.5 结果出现恒久沉淀物为阳性。3. 10 曹养明胶3. 10. 1 成分蛋白陈牛肉膏明胶蒸馆水5 g 3 g 120 g 1 000 mL pH6. 87. 0 3. 10. 2 制法加热溶解、校正至pH7.47. 6.分装小管.121C高压灭菌10min,取出后迅速冷却,使其凝固。复查最终pH应为6.87.0.3. 10. 3 试验方法用琼脂培养物穿刺接种,放
19、在22C25C培养,每天观察结果,记录液化时间。或放在36C土IC培养,每天取出,放冰箱内30min后再观察结果。3. 11 苯丙氨酸培养基3. 11. 1 成分酵母浸膏DI苯丙氨酸(或L苯丙氨酸1g) 磷酸氢二饷氯化纳琼脂蒸馆水bgbgb 321i 5 g 12 g 1000 mL 3. 11. 2 制法加热溶解后分装试管.121C高压灭菌15min,便成斜面。3. 11. 3 试验方法自琼脂斜面上挑取大量培养物,移种于苯丙氨酸琼脂,在36C土IC培养4h或18h24 h。滴加10%三氯化铁溶液2滴3滴,自斜面培养物上流下,苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。3. 12 氨基酸脱竣酶试验培养基3.
20、 12. 1 成分蛋白陈酵母浸膏葡萄糖蒸馆水1.6%澳甲盼紫-乙醇溶液L-氨基酸或OL-氨基酸pH6.8 gbghugb 531 1 000 mL 1 mL 0.5或1g/IOO mL 199 GB/T 4789.28-2003 3. 12.2 制法除氨基酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入各种氨基酸z赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L氨基酸按0.5%加入,DL氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内,每管0.5mL.上面滴加-层液体石蜡.115C高压灭菌10mino 3. 12. 3 试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36C土1C培养18
21、h24 h.观察结果。氨基酸脱竣酶阳性者由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者元碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。3. 13 蛋白陈水(障基质试验用)3. 13. 1 成分蛋白陈或膜蛋白陈)氯化纳蒸储水pH7.4 3. 13. 2 司司法20 g 5 g 1000 mL 按上述成分配制,分装小试管.121C高压灭菌15mio, 3. 13. 3 霞基质试剂3. 13. 3. 1 柯凡克试剂.将5g对二甲氨基甲醒溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。3.13.3.2 欧波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醒熔解于95mL95%乙醇内,然后缓慢加入浓盐酸20mL, 3. 1
22、3. 4 试验方法挑取小量培养物接种,在36C士1C培养1d2 d.必要时可培养4d5 d.加入柯儿克试剂约0.5 mL.轻摇民管,阳性者于试剂层呈深红色g或加入欧波试剂约0.5mL.沿管壁流下,覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注g蛋白陈中应吉再丰富的色氨酸。每批蛋白陈买来后,应先用己知菌种鉴定后方可使用。3. 14 硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用)3. 14. 1 成分牛肉膏3 g 酵母浸膏3 g 蛋白陈10 g 硫酸亚铁0.2日硫代硫酸纳0.3 g 氯化纳5 g 琼脂12日蒸馆水1000 mL pH7.4 3. 14.2 制法加热溶解,校正pH.分装试管.115C高压灭菌15m
23、in,取出直立候其凝固。3. 14. 3 试验方法挑取琼脂培养物,沿管壁穿刺,于36C土IC培养1d2 d,观察结果。产硫化氢者使培养基变为黑色。注g肠抨菌科细菌测定硫化氢的产生,应采用三糖铁琼脂或本培养基。3. 15 尿素琼n3. 15. 1 成分蛋白豚200 1 g 氯化纳葡萄糖磷酸二氢御0.4%盼红溶液琼脂蒸馆水20%尿素溶液pH7.2士o.1 3. 15.2 制法GBjT 4789.28-2003 5 g 1 g 2g 3 mL 20 g 1000 mL 100 mL 将除尿素和琼脂以外的成分配好,并校正pH.加入琼脂,加热溶化并分装烧瓶。121c高压灭菌15 min。冷至50.C55
24、.C.加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%.最终pH应为7.2土。1.分装于灭菌试管内,放成斜面备用。3. 15.3 试验方法挑取琼脂培养物接种,在36.C士I.C培养24h.观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。3. 16 氧化饵(KCN)培养基3. 16. 1 成分蛋白陈氯化纳磷酸二氧梆磷酸氢二锅蒸馆水0.5%氟化饵溶液pH7.6 3. 16.2 制法10 g 5 g O. 225 g 5.64 g 1000 mL 20 mL 将除氟化饵以外的成分配好后分装烧瓶.121.C高压灭菌15mino放在冰箱内使其充分冷却。每100 mL培养基加入0.5%氟化御溶液2.0mL
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