1、中华人民共和国出入境检瞌检疫行业标准SN/3767.10-2014 出口食晶中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第10部分:玉米MON88017晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 10: Maize MON880 17 2014-01-13发布2014-08-01实施飞、轨臼至13)-泊J咱b o r望8飞网络m州cntw315e1同电语4006也J15fijlj;:GitilJih 中
2、华人民人共和国发布匪家质量监督但验栓疫总局SN/T 3767.10-2014 目。SN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系
3、;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40叩3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第10部分。本部分按照GB/1.
4、1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:曾静、马丹、张营、张林、魏海南、张西萌、李志勇、石磊、常彦磊。I SN/T 3767.10-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第10部分:玉米MON88017品系1 范围017品系特异性的环介导等泪扩SN/T 3767的本部分规定了增(LAMP)初筛
5、检测方法。本部分适用于玉米及其制品本方法的定性检测低限为O.的定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用件。凡是不注目期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室用件，仅注目期的版本适用于本文本文件。GB/T 19495.7 转基因产品SN/T 3767.2-2014 出口选方法LAMP)检测方法第2部分:筛3 防污染措施环介导等温扩增检测过程定4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因玉米MON88017品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一
6、对，特SN/T 3767.10-2014 异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，并设计一条环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸兰磷酸、寡核音酸引物在B聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链土互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结梅的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸馍)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Gree口1:一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。;当它与双链D
7、NA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由憧色变为绿色。钙黄绿素:在LAMP反应体系中加入预先泪合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锚离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被悴灭，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与组离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锚离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镜离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在36
8、5nm紫外光激发下散发出约510 nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水帘锅或加热模板:65.0 oC土0.5oC和85.0oC土0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mLo 6.2.4 移液器:量程0.5fLL10L;量程10L100fLL;量程100L1 000 fLL。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs 容液:每种核昔酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有
9、同等效果的DNA聚合酶):酶放度8U/fL L 6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCICpH值8.8)、100mmol/L硫酸镜、100mmol/L氧化饵、20mmol/L硫酸镇、l%TritonX-100。6.3.5 硫酸镜恪液:50mmol/Lo 6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:钙黄绿素荧光染料0.312mol/L和SYBRGreen 1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米MON88017品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2，和环状下游引物LB。2 外引物
10、扩增片段长度:206bp 夕卡引物1CF3 , 5 -3) : GCTAGCTTGATGGGGATCAG 外引物2CB3, 5 -3) :CTTGTAGATGGCACCGCG 内引物1C FIP , 5 -3 ): GGCAG T A TGCCGG AG TTG ACC-TCG TTTCCCGCCTTCAG T 内引物2CBIP，5-3): CTGGCCGCACGCAGGAAAAATA-CTGTCGTGTCTGACCAAGG 下游环引物CBLP , 5 -3 ) : GGGCG AA TCAG AAAGGGCG T SN/l、3767.10-20146.4 检测步骤6.4 .1 阴性对照、拥性
11、对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:采用不含有待j则基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性又才照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4 .1.3 设两个空白对照:一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一一-LAMP反应的空白对照(以DNA榕解液代替DNA模板)0 6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;杏则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米MON88017
12、品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA梅液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。表1玉米MON88017品系LAMP反应体系组分仁作i夜浓度加样量/f1L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2.5 1 外引物1C白)10 /1 mol/L 0.5 0.2 /1 mol/L 外引物2CB3)10mol/L 0.5 0.2mol/L 内寻|物lCFIP)40mol/L 1 1.6mol/L 内引物2C BIP) 40 /1 mol/L 1 1.6mol/L 下游环引物CBLP)40mol/L 0.5 0.8mol/L dNTP 10 mmol
13、/L 3.5 1. 4 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 5 1 mol/L MgSO , 50 mmol/L 2 4 mmol/L 钙黄绿素CCalcein)0.312 mol/L 0.5 6.3 mmol/L Bsl DNA聚合酶8 U/1 L 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/L ?k 补足至25.0且如果使用SYBRGreen 1染料，反应体系中不预先混合荧光染料，多余体积用水补充至25L，在反应体系配制完成后，将lL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。6.4.4 LAMP反应参数65.0 oc土0.5oc恒温扩增60min ,
14、85.0 oc土0.5oC 2 min使酶灭活，反应结束。3 SN/T 3767.10-2014 6.4 .5 显色反应6.4.5.1 钙黄绿素染料体系:反应结束后，在黑色背景下立即进行颜色结果观察。6.4.5.2 SYBR Green 1染料体系:反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 6.5.3 阴性对照:反应管中液体6.5.4 阳性对照:反应管中液体7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管
15、中液果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应8 结果表述8.1 检测结果为阴性，表述为8.2 检测结果为转基因玉米表述。4 验对照结果正常，可判断该样品证见附录A): 照确证实验情况进行结果判断和SN/T 3767.10-2014 附录A(资料性附录)转基因玉米MON88017品系基因序列A.1 转基因玉米MON88017品系外源基因和玉米边界序列7171 GACCTGCAGA AGCTAGCTTG ATGGGGATCA GATTGTCGTT TCCCGCCTTC 7221 AGTTTAAACA GAGTCGGGTTTGGATGGCAACTCCGG仁ATACTGCCGAAA 7271 ACAA
16、ACCAAT CCGTCACCGT CAAGGCCCCG CACCGCTGGC CGCACGCAGG 7321 AAAAATAAGT TGCGACCGCG AGCGGGCGAA TCAGAA必GGGCG TCCGGCCT 7371 TGGTCAGACA CGACAGCCACGCGGAAAGGC TGCGCCCCG GTGCCATCTA / 7421 CAAGGGTCCA A.2 引物碱基序列及构成F3: GCTAGCTTGATGGGGATCAG B3: CTTGTAGATGGCACCGCG F1c FIP: GGCAGTATGCCGGAGTTGAGC DA YE-口u5 ZON|OFKuh的H在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第10部分:玉米MON88017品系SN/T 3767.10-2014 * 中国标i自出版社出版北京市朝阳区和平里回街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴印张0.75字数12千字2014年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2014年11月第一版印数1-1300 定价16.00元只书号:155066 2-27437 SN/T 3767.10-2014
